Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung und Durchführung eines Kratzwundtests an zweidimensionalen (2D) Monoschichten, die aus dreidimensionalen (3D) Enteroiden abgeleitet sind, die aus nichtmenschlichem Primatenileum isoliert wurden.
Abstract
In-vitro-Kratzwund-Assays werden häufig verwendet, um die Mechanismen und Eigenschaften der Epithelheilung in einer Vielzahl von Gewebetypen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer zweidimensionalen (2D) Monoschicht aus dreidimensionalen (3D) nichtmenschlichen Primatenenteroiden, die aus Darmkrypten des terminalen Ileums stammen. Diese enteroid-abgeleiteten Monoschichten wurden dann in einem In-vitro-Kratzwund-Assay verwendet, um die Fähigkeit von Hyaluron 35 kDa (HA35), einer menschlichen Milch-HA-Nachahmung, zu testen, Zellmigration und -proliferation entlang der epithelialen Wundkante zu fördern. Nachdem die Monolagen bis zum Konfluenzen gewachsen waren, wurden sie manuell zerkratzt und mit HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder Kontrolle (PBS) behandelt. Die Zellmigration und -proliferation in die Lücke wurde mit einem Durchlichtmikroskop abgebildet, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet war. Der Wundverschluss wurde mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin in ImageJ als prozentuale Wundheilung quantifiziert. Die Kratzfläche und die Rate der Zellmigration sowie der Prozentsatz des Wundverschlusses wurden über 24 h gemessen. HA35 beschleunigt in vitro die Wundheilung in Dünndarm-Enteroid-Monoschichten, wahrscheinlich durch eine Kombination aus Zellproliferation am Wundrand und Migration in den Wundbereich. Diese Methoden können möglicherweise als Modell verwendet werden, um die Darmregeneration im Frühdarm des menschlichen Dünndarms zu untersuchen.
Introduction
Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist einer der häufigsten gastrointestinalen Notfälle bei Frühgeborenen1. Die Krankheit ist durch eine schwere Darmentzündung gekennzeichnet, die sich schnell zu Darmnekrose, Sepsis und möglicherweise zum Tod verschlechtern kann. Obwohl die Ätiologie unklar ist, deuten Hinweise darauf hin, dass NEC multifaktoriell ist und das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung von Fütterung, abnormaler bakterieller Besiedlung und einem unreifen Darmepithelist 2,3. Frühgeborene haben eine erhöhte Darmpermeabilität, eine abnormale bakterielle Besiedlung und eine niedrige Enterozytenregenerationskapazität4,5, was ihr Risiko für Darmbarrierestörungen, bakterielle Translokation und NEC-Entwicklung erhöht. Daher ist die Identifizierung von Strategien oder Interventionen zur Beschleunigung der Darmepithelreifung und zur Förderung der Regeneration oder Heilung des Darmepithels entscheidend für die Verhinderung dieser tödlichen Krankheit.
Studien haben gezeigt, dass Muttermilch (HM) bei Frühgeborenen 6,7,8,9,10,11 vor NEC schützt. Sowohl Human- als auch Tierstudien haben gezeigt, dass die Formel auf Rinderbasis die Darmpermeabilität erhöht und direkt toxisch für Darmepithelzellen ist 2,12. Obwohl nicht vollständig aufgeklärt, deuten Beweise darauf hin, dass die schützende Wirkung von HM durch bioaktive Komponenten wie Lactoferrin, Immunglobulin A (IgA) und HM-Oligosaccharide vermitteltwird 13. HM ist auch reich an Hyaluron (HA), einem einzigartigen sulfatfreien Glykosaminoglykan mit wiederholter D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharide14,15. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass orale 35 kDa HA (HA35), eine HM HA-Nachahmung, die Schwere der Darmverletzung abschwächt, bakterielle Translokation verhindert und die Mortalität in einem murinen NEC-ähnlichen Darmverletzungsmodell verringert16,17.
Hier werden die Wirkungen von HA35 auf die Darmheilung und Regeneration in vitro weiter untersucht. Derzeit ist der am weitesten verbreitete In-vitro-Assay für Darmverletzung und -reparatur ein Kratzwundtest, der in Darmkrebszellmonoschichten (CRC) durchgeführt wird. Die physiologische Relevanz eines solchen Modells für den Frühgeborenendarm ist begrenzt, da die Wundreparatur von Darmkrebszellen stark von der hochgradig proliferativen Natur von Krebszellen und nicht von stammzellgesteuerten Reparaturprozessen abhängt18. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird hier die Etablierung eines enteroiden 2D-Kratzwundmodells beschrieben, einschließlich des Verfahrens zur Isolierung und Aufrechterhaltung primärer Stammzell-abgeleiteter Dünndarmenteroide von Frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten (NHP). Da vorzeitige NEC am häufigsten im distalen Dünndarm berichtet wird, liefert die Verwendung von primären Epithelzellorganoiden in einem Modell der Darmschädigung und -reparatur ein physiologisch besser übersetzbares In-vitro-Modell im Vergleich zu bestehenden Modellen, die traditionelle kolorektale Monoschichten verwenden18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Magen-Darm-Trakt eines Frühgeborenen steht unter ständigem regenerativem Druck durch wiederholte Exposition gegenüber Umwelteinflüssen im Zusammenhang mit Dysbiose, entzündlichen bakteriellen Metaboliten und Toxinen und intermittierender Hypoxie23,24. Leider ist das Darmepithel des Frühgeborenen nicht in der Lage, schnell funktionelle Integrität herzustellen23, was zu Barrierestörungen, erhöhter Darmpermeabilität und in schwe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children’s Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Lebendzellbildgebungsdienste, die vom Kern der Cancer Functional Genomics bereitgestellt werden, wurden teilweise durch den National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 und den National Cancer Institute Grant P30CA225520 der National Institutes of Health unterstützt, die an das Stephenson Cancer Center der University of Oklahoma Health Sciences Center vergeben wurden.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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