تأثير حمض الهيالورونيك 35 كيلو دال أمبير على نموذج في المختبر للإصابات المعوية الصغيرة المبكرة والشفاء باستخدام الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لإنشاء وإجراء فحص جرح خدش على طبقات أحادية ثنائية الأبعاد (2D) مشتقة من الأمعاء ثلاثية الأبعاد (3D) المعزولة من الدقاق الرئيسي غير البشري.
Abstract
تستخدم فحوصات الجرح في المختبر بشكل شائع للتحقيق في آليات وخصائص الشفاء الظهاري في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد (2D) من المعوية الرئيسية ثلاثية الأبعاد (3D) غير البشرية المشتقة من الخبايا المعوية للدقاق الطرفي. ثم تم استخدام هذه الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء في فحص جرح خدش في المختبر لاختبار قدرة الهيالورونان 35 كيلو دال (HA35) ، وهو حليب بشري يحاكي HA ، لتعزيز هجرة الخلايا وانتشارها على طول حافة الجرح الظهارية. بعد زراعة الطبقات الأحادية إلى التقاء ، تم خدشها يدويا ومعالجتها باستخدام HA35 (50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل) أو التحكم (PBS). تم تصوير هجرة الخلايا وانتشارها إلى الفجوة باستخدام مجهر ضوئي منقول مجهز لتصوير الخلايا الحية. تم تحديد إغلاق الجروح كميا كنسبة مئوية من التئام الجروح باستخدام المكون الإضافي لحجم التئام الجروح في ImageJ. تم قياس منطقة الخدش ومعدل هجرة الخلايا والنسبة المئوية لإغلاق الجرح على مدار 24 ساعة. HA35 في المختبر يسرع التئام الجروح في الطبقات الأحادية المعوية المعوية الصغيرة ، على الأرجح من خلال مزيج من تكاثر الخلايا عند حافة الجرح والهجرة إلى منطقة الجرح. يمكن استخدام هذه الطرق كنموذج لاستكشاف تجديد الأمعاء في الأمعاء الدقيقة البشرية المبكرة.
Introduction
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو واحد من أكثر حالات الطوارئ المعدية المعوية شيوعا عند الأطفال الخدج1. يتميز المرض بالتهاب معوي حاد يمكن أن يتدهور بسرعة إلى نخر معوي وتعفن الدم وربما الموت. على الرغم من أن المسببات غير واضحة ، إلا أن الأدلة تشير إلى أن NEC متعدد العوامل ونتيجة لتفاعل معقد للتغذية ، واستعمار بكتيري غير طبيعي ، وظهارة معوية غير ناضجة 2,3. زاد الأطفال الخدج من نفاذية الأمعاء ، والاستعمار البكتيري غير الطبيعي ، وانخفاض القدرة التجديدية للخلايا المعوية 4,5 ، مما يزيد من خطر إصابتهم بخلل في الحاجز المعوي ، ونقل البكتيريا ، وتطوير NEC. لذلك ، فإن تحديد الاستراتيجيات أو التدخلات لتسريع النضج الظهاري المعوي وتعزيز تجديد أو شفاء الظهارة المعوية أمر بالغ الأهمية في الوقاية من هذا المرض الفتاك.
أظهرت الدراسات أن الحليب البشري (HM) يحمي من NEC في الأطفال الخدج6،7،8،9،10،11. أظهرت كل من الدراسات البشرية والحيوانية أن الصيغة القائمة على الأبقار تزيد من نفاذية الأمعاء وهي سامة مباشرة للخلايا الظهارية المعوية 2,12. على الرغم من عدم توضيحها بالكامل ، تشير الأدلة إلى أن الآثار الوقائية ل HM يتم بوساطة المكونات النشطة بيولوجيا مثل اللاكتوفيرين والغلوبولين المناعي A (IgA) و HM oligosaccharides13. HM غني أيضا بالهيالورونان (HA) ، وهو جليكوزامينوغليكان غير كبريتات فريد من نوعه مع تكرار حمض D-glucuronic و N-acetyl-D-glucosamine disaccharides14,15. الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أن الفم 35 kDa HA (HA35) ، وهو تقليد HM HA ، يخفف من شدة الإصابة المعوية ، ويمنع نقل البكتيريا ، ويقلل من الوفيات في نموذج إصابة معوية تشبه الفئران NEC16,17.
هنا ، يتم التحقيق بشكل أكبر في آثار HA35 على الشفاء المعوي والتجديد في المختبر. حاليا ، الفحص الأكثر استخداما في المختبر لجرح الأمعاء وإصلاحها هو فحص جرح الخدش الذي يتم إجراؤه في الطبقات الأحادية لخلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC). إن الأهمية الفسيولوجية لمثل هذا النموذج لأمعاء الرضع الخدج محدودة ، حيث يعتمد إصلاح الجروح لخلايا CRC بشكل كبير على الطبيعة التكاثرية للغاية للخلايا السرطانية بدلا من عمليات الإصلاح التي تحركها الخلايا الجذعية18. للتغلب على هذا القيد ، يتم وصف إنشاء نموذج جرح خدش الأمعاء 2D ، بما في ذلك إجراء عزل والحفاظ على الأمعاء المعوية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية الأولية من الرئيسيات غير البشرية الخدج (NHP) ، هنا. بالنظر إلى أن NEC قبل الأوان غالبا ما يتم الإبلاغ عنه في الأمعاء الدقيقة البعيدة ، فإن استخدام الخلايا العضوية الظهارية الأولية في نموذج للتلف والإصلاح المعوي يوفر نموذجا أكثر قابلية للترجمة الفسيولوجية في المختبر مقارنة بالنماذج الحالية التي تستخدم الطبقات الأحادية التقليدية للقولون والمستقيم18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتعرض الجهاز الهضمي للرضيع الخدج لضغط تجديدي مستمر من التعرض المتكرر للإهانات البيئية المرتبطة ب dysbiosis ، والمستقلبات البكتيرية الالتهابية والسموم ، ونقص الأكسجة المتقطع23,24. لسوء الحظ ، فإن الظهارة المعوية للرضيع المبتس غير قادرة على إثبات السلامة الوظيفي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). تم دعم خدمات تصوير الخلايا الحية التي يقدمها مركز علم الجينوم الوظيفي للسرطان جزئيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20GM103639 والمعهد الوطني للسرطان منحة P30CA225520 من المعاهد الوطنية للصحة ، الممنوحة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما مركز ستيفنسون للسرطان.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn’s disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
