Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides
Summary
Este protocolo describe un método para establecer y realizar un ensayo de herida por rasguño en monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides tridimensionales (3D) aislados del íleon de primates no humanos.
Abstract
Los ensayos de heridas por rasguño in vitro se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos y características de la curación epitelial en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, describimos un protocolo para generar una monocapa bidimensional (2D) a partir de enteroides de primates no humanos tridimensionales (3D) derivados de criptas intestinales del íleon terminal. Estas monocapas derivadas de enteroides se utilizaron en un ensayo in vitro de herida por rasguño para probar la capacidad del hialuronano 35 kDa (HA35), un imitador de HA de la leche humana, para promover la migración y proliferación celular a lo largo del borde de la herida epitelial. Después de que las monocapas se cultivaron hasta la confluencia, se rayaron manualmente y se trataron con HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) o control (PBS). La migración celular y la proliferación en la brecha se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de luz transmitida equipado para imágenes de células vivas. El cierre de la herida se cuantificó como porcentaje de cicatrización de heridas utilizando el complemento Wound Healing Size en ImageJ. El área de rasguño y la tasa de migración celular y el porcentaje de cierre de la herida se midieron durante 24 h. HA35 in vitro acelera la cicatrización de heridas en monocapas enteroides del intestino delgado, probablemente a través de una combinación de proliferación celular en el borde de la herida y migración al área de la herida. Estos métodos pueden usarse potencialmente como modelo para explorar la regeneración intestinal en el intestino delgado humano prematuro.
Introduction
La enterocolitis necrosante (ECN) es una de las urgencias gastrointestinales más frecuentes en lactantes prematuros1. La enfermedad se caracteriza por una inflamación intestinal severa que puede deteriorarse rápidamente a necrosis intestinal, sepsis y potencialmente la muerte. Aunque la etiología no está clara, la evidencia sugiere que la ECN es multifactorial y el resultado de una compleja interacción de alimentación, colonización bacteriana anormal y epitelio intestinal inmaduro 2,3. Los lactantes prematuros tienen mayor permeabilidad intestinal, colonización bacteriana anormal y baja capacidad regenerativa de enterocitos4,5, lo que aumenta el riesgo de disfunción de la barrera intestinal, translocación bacteriana y desarrollo de NEC. Por lo tanto, identificar estrategias o intervenciones para acelerar la maduración epitelial intestinal y promover la regeneración o curación del epitelio intestinal es fundamental para prevenir esta enfermedad mortal.
Los estudios han demostrado que la leche materna (HM) protege contra la ECN en lactantes prematuros 6,7,8,9,10,11. Tanto los estudios en humanos como en animales han demostrado que la fórmula de base bovina aumenta la permeabilidad intestinal y es directamente tóxica para las células epitelialesintestinales 2,12. Aunque no está completamente dilucidado, la evidencia sugiere que los efectos protectores de HM están mediados por componentes bioactivos como lactoferrina, inmunoglobulina A (IgA) y oligosacáridos HM13. HM también es rico en hialuronano (HA), un glicosaminoglicano no sulfatado único con ácido D-glucurónico repetitivo y N-acetil-D-glucosamina disacáridos14,15. Es importante destacar que hemos demostrado que el HA oral de 35 kDa (HA35), un imitador de HM HA, atenúa la gravedad de la lesión intestinal, previene la translocación bacteriana y disminuye la mortalidad en un modelo murino de lesión intestinal similar a NEC16,17.
Aquí, los efectos de HA35 en la curación intestinal y la regeneración in vitro se investigan más a fondo. Actualmente, el ensayo in vitro más utilizado para heridas intestinales y reparación es un ensayo de herida por rasguño realizado en monocapas de células de cáncer colorrectal (CCR). La relevancia fisiológica de tal modelo para el intestino del lactante prematuro es limitada, ya que la reparación de heridas de las células del CCR depende en gran medida de la naturaleza altamente proliferativa de las células cancerosas en lugar de los procesos de reparación impulsados por células madre18. Para superar esta limitación, aquí se describe el establecimiento de un modelo de herida por rasguño enteroide 2D, incluido el procedimiento de aislamiento y mantenimiento de enteroides intestinales delgados derivados de células madre primarias de primates prematuros no humanos (NHP). Dado que la ECN prematura se informa con mayor frecuencia en el intestino delgado distal, el uso de organoides de células epiteliales primarias en un modelo de daño y reparación intestinal proporciona un modelo in vitro más fisiológicamente traducible en comparación con los modelos existentes que utilizan monocapas colorrectales tradicionales18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tracto gastrointestinal de un recién nacido prematuro está bajo presión regenerativa continua por exposiciones repetidas a insultos ambientales asociados con disbiosis, metabolitos y toxinas bacterianas inflamatorias, e hipoxia intermitente23,24. Desafortunadamente, el epitelio intestinal del recién nacido prematuro es incapaz de establecer rápidamente la integridad funcional23, lo que resulta en disfunción de barrera, aumento de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children’s Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Los servicios de imágenes de células vivas proporcionados por el núcleo de Genómica Funcional del Cáncer fueron apoyados en parte por la Subvención P20GM103639 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la Subvención P30CA225520 del Instituto Nacional del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer, otorgada al Centro de Ciencias de la Salud Stephenson del Centro de Cáncer Stephenson de la Universidad de Oklahoma.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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