Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.
Abstract
I saggi in vitro delle ferite da graffio sono comunemente usati per studiare i meccanismi e le caratteristiche della guarigione epiteliale in una varietà di tipi di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per generare un monostrato bidimensionale (2D) da enteroidi primati non umani tridimensionali (3D) derivati da cripte intestinali dell’ileo terminale. Questi monostrati derivati da enteroidi sono stati poi utilizzati in un test in vitro per testare la capacità dell’acido ialuronico 35 kDa (HA35), un imitatore di HA del latte umano, di promuovere la migrazione e la proliferazione cellulare lungo il bordo della ferita epiteliale. Dopo che i monostrati sono cresciuti fino alla confluenza, sono stati graffiati manualmente e trattati con HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) o controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l’imaging di cellule vive. La chiusura della ferita è stata quantificata come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size in ImageJ. L’area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell’arco di 24 ore. HA35 in vitro accelera la guarigione delle ferite nei piccoli monostrati enteroidi intestinali, probabilmente attraverso una combinazione di proliferazione cellulare sul bordo della ferita e migrazione verso l’area della ferita. Questi metodi possono potenzialmente essere utilizzati come modello per esplorare la rigenerazione intestinale nell’intestino tenue umano pretermine.
Introduction
L’enterocolite necrotizzante (NEC) è una delle emergenze gastrointestinali più comuni nei neonati pretermine1. La malattia è caratterizzata da una grave infiammazione intestinale che può rapidamente deteriorarsi in necrosi intestinale, sepsi e potenzialmente morte. Sebbene l’eziologia non sia chiara, l’evidenza suggerisce che la NEC è multifattoriale ed è il risultato di una complessa interazione di alimentazione, colonizzazione batterica anormale e epitelio intestinale immaturo 2,3. I neonati pretermine hanno aumentato la permeabilità intestinale, la colonizzazione batterica anormale e una bassa capacità rigenerativa degli enterociti4,5, aumentando il rischio di disfunzione della barriera intestinale, traslocazione batterica e sviluppo di NEC. Pertanto, identificare strategie o interventi per accelerare la maturazione epiteliale intestinale e promuovere la rigenerazione o la guarigione dell’epitelio intestinale è fondamentale per prevenire questa malattia mortale.
Gli studi hanno dimostrato che il latte umano (HM) è protettivo contro NEC nei neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. Studi sia sull’uomo che sugli animali hanno dimostrato che la formula a base bovina aumenta la permeabilità intestinale ed è direttamente tossica per le cellule epiteliali intestinali 2,12. Sebbene non completamente chiarito, l’evidenza suggerisce che gli effetti protettivi dell’HM sono mediati attraverso componenti bioattivi come la lattoferrina, l’immunoglobulina A (IgA) e gli oligosaccaridi HM13. HM è anche ricco di acido ialuronico (HA), un glicosaminoglicano unicamente non solfato con acido D-glucuronico ripetuto e disaccaridi N-acetil-D-glucosamina14,15. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che 35 kDa HA orale (HA35), una imitazione HM HA, attenua la gravità del danno intestinale, previene la traslocazione batterica e diminuisce la mortalità in un modello murino di danno intestinale simile a NEC16,17.
Qui, gli effetti di HA35 sulla guarigione intestinale e sulla rigenerazione in vitro sono ulteriormente studiati. Attualmente, il test in vitro più utilizzato per le ferite e la riparazione intestinale è un test di ferita da graffio eseguito in monostrati di cellule di cancro del colon-retto (CRC). La rilevanza fisiologica di un tale modello per l’intestino infantile pretermine è limitata, poiché la riparazione delle ferite delle cellule CRC dipende fortemente dalla natura altamente proliferativa delle cellule tumorali piuttosto che dai processi di riparazione guidati dalle cellule staminali18. Per superare questa limitazione, qui viene descritta la creazione di un modello 2D di ferita da graffio enteroide, compresa la procedura di isolamento e mantenimento di enteroidi intestinali piccoli intestinali derivati da cellule staminali primarie da primati non umani pretermine (NHP). Dato che la NEC pretermine è più spesso riportata nell’intestino tenue distale, l’uso di organoidi di cellule epiteliali primarie in un modello di danno intestinale e riparazione fornisce un modello in vitro più fisiologicamente traducibile rispetto ai modelli esistenti che utilizzano monostrati colorettali tradizionali18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tratto gastrointestinale di un neonato pretermine è sottoposto a continua pressione rigenerativa da ripetute esposizioni a insulti ambientali associati a disbiosi, metaboliti batterici infiammatori e tossine e ipossia intermittente23,24. Sfortunatamente, l’epitelio intestinale del neonato pretermine non è in grado di stabilire rapidamente l’integrità funzionale23, con conseguente disfunzione della barriera, aumento della permeabilit?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children’s Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). I servizi di imaging delle cellule vive forniti dal nucleo di genomica funzionale del cancro sono stati supportati in parte dal National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e dal National Cancer Institute Grant P30CA225520 del National Institutes of Health, assegnato al Centro di scienze della salute dell’Università dell’Oklahoma Stephenson Cancer Center.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn’s disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
