Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Eks Vivo Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63855
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

Summary

Denne protokollen beskriver prosessen med generering og karakterisering av mus urothelial organoider som skjuler slettinger i gener av interesse. Metodene inkluderer høsting av mus urothelial celler, ex vivo transduksjon med adenovirus kjøring Cre uttrykk med en CMV promotør, og in vitro samt in vivo karakterisering.

Abstract

Blærekreft er et undervurdert område, spesielt i genmodifiserte musemodeller (GEMMs). Innavlede GEMMs med vevsspesifikke Cre- og loxP-nettsteder har vært gullstandardene for betinget eller inducible genmålretting. For å gi raskere og mer effektive eksperimentelle modeller, utvikles et ex vivo organoid kultursystem ved hjelp av adenovirus Cre og normale urothelialceller som bærer flere loxP-alleler av tumordemperne Trp53, Pten og Rb1. Normale urotelceller er enzymatisk disassosiert fra fire blærer med trippel floxed mus (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheliale cellene transduseres ex vivo med adenovirus-Cre drevet av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transinduserte blæreorganoidene dyrkes, forplantes og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR brukes til å bekrefte gensletting i Trp53, Pten og Rb1. Immunfluorescens (IF) farging av organoider viser positivt uttrykk for uroteliale avstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoidene injiseres subkutant i vertsmus for tumorutvidelse og serielle passasjer. Immunhistokjemien (IHC) av xenografts viser positivt uttrykk for CK7, CK5 og p63 og negativt uttrykk for CK8 og Uroplakin 3. Oppsummert er adenovirusmediert gensletting fra mus urothelialceller konstruert med loxP-nettsteder en effektiv metode for raskt å teste det tumorigeniske potensialet til definerte genetiske endringer.

Introduction

Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og rammer mer enn 80.000 mennesker årlig i USA1. Platinabasert kjemoterapi har vært standarden for omsorg for pasienter med avansert blærekreft i mer enn tre tiår. Landskapet av blærekreft behandling har blitt revolusjonert av den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun sjekkpunkthemmere), erdafitinib (en fibroblast vekstfaktor reseptor inhibitor) og enfortumab vedotin (en antistoff-narkotika konjugat)2,3,4. Imidlertid er ingen klinisk godkjente biomarkører tilgjengelige for å forutsi responsen på kjemoterapi eller immunterapi. Det er et kritisk behov for å generere informative prekliniske modeller som kan forbedre forståelsen av mekanismene som driver blærekreftprogresjonen og utvikle prediktive biomarkører for ulike behandlingsmodaliteter.

Et stort hinder i blæreoversettelsesforskning er mangelen på prekliniske modeller som rekapitulerer human blærekreftpatogenese og behandlingsresponser 5,6. Flere prekliniske modeller er utviklet, inkludert in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerte celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) og in vivo-modeller (xenograft, kreftfremkallende, genetisk konstruerte modeller og pasientavledede xenograft)2,6. Genmodifiserte musemodeller (GEMMs) er nyttige for mange anvendelser innen blærekreftbiologi, inkludert analyser av tumorfenotyper, mekanistiske undersøkelser av kandidatgener og/eller signalveier, og den prekliniske evalueringen av terapeutiske responser 6,7. GEMMs kan bruke stedsspesifikke rekombininaer (Cre-loxP) for å kontrollere genetiske slettinger i ett eller flere tumordempergener. Prosessen med å generere ønskede GEMMs med flere genslettinger er tidkrevende, arbeidskrevende ogdyrt 5. Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en rask og effektiv metode for ex vivo Cre-levering for å etablere blære trippel knockout (TKO) modeller fra normale mus urothelialceller som bærer trippel floxed alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordelen med ex vivo-metoden er den raske arbeidsflyten (1-2 uker i stedet for år med museavl). Denne artikkelen beskriver protokollen for høsting av normale urotelceller med floxed alleler, ex vivo adenovirustransduksjon, organoide kulturer og in vitro og in vivo-karakterisering i immunokortogene C57 BL/6J-mus. Denne metoden kan videre brukes til å generere klinisk relevante blærekreftorganoider i immunompetente mus som skjuler enhver kombinasjon av floxed alleler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, Biosafety 180501 og 180502).
MERK: Utfør trinn 1-3 på samme dag.

1. Disseksjon av museblære

  1. Forberedelse til disseksjon
    1. Forbered alle sterile instrumenter, inkludert saks, tang, steril DPBS i 35 mm kulturretter, 70% etanol, steril gasbind og rene papirhåndklær. Rengjør alle overflater på disseksjonsområdet. Generer mannlige trippel floxed mus Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 mus, 10 uker gammel), som tidligere beskrevet i Dr. Goodrichs lab 8.
  2. Eutanasi og snitt
    1. Avlivet musene ved CO 2-kvelning ved hjelp av en strømningshastighet på 2,0 l/min, etterfulgt av livmorhalsdislokasjon. Rengjør disseksjonsområdet med 70% etanol og dekk med et rent papirhåndkle.
    2. Plasser musen på gasbind i disseksjonsområdet. Spray 70% etanol på musens underliv og bruk steril disseksjonssaks for å gjøre et nedre midtlinje abdominal snitt som utsetter blæren.
  3. Dissekere blæren
    1. Bruk tang for å gripe blæren og trekk forsiktig opp slik at bilaterale ureteriske veikryss identifiseres. Bruk saks for å fjerne blærefondet etter grenselinjen mellom de to urinlederens åpninger.
    2. Overfør blæren til en steril tallerken med 2 ml DPBS. Fjern fett og bindevev og legg blæren i en ny tallerken med steril 2 ml DPBS. På dette tidspunktet, ta adenoviruset ut fra -80 ° C lagring og hold det på is.

2. Dissosiasjon av urotheliale celler

  1. Forberedelse for celledissosiasjon
    1. Forbered alle sterile instrumenter, inkludert tang, kirurgiske skalpeller (et størrelse 10 blad med håndtak), sterile DPBS i 35 mm kulturretter, komplett kultur medium uten kull-strippet FBS definert som CCM (-), kollagenase / hyaluronidase blanding, rekombinant enzym for trypsin erstatning, 10% kull-strippet FBS i DPBS med 10 μM frisk Y-27632, en 100 μm steril celle sil, og en 15 mL sentrifuge rør.
      MERK: Det komplette kulturmediet (CCM) består av pattedyr epitelcellevekst medium supplert med de medfølgende vekstfaktorene og 5% kull-strippet FBS, 1% L-glutamin erstatning, 100 μg / ml primocin, og 10 μM frisk Y-27632.
  2. Mincing og fordøye blæren
    1. Overfør og vask blæren igjen med 2 ml steril DPBS i en 35 mm tallerken i et biosikkerhetsskap.
    2. Samle blærevev fra fire mus i en tallerken med 1 ml CCM (-) og hakk hver blære i fire like deler ved hjelp av et kirurgisk blad. Bruk tang til å utfolde blæren for å eksponere urotheliumoverflaten til mediet.
    3. Overfør blærestykkene og mediet til et 15 ml sentrifugerør. Vask retten med 2 ml CCM(-) 2x og samle den i et sentrifugerør til et totalt volum på 5 ml.
    4. Tilsett kollagenase/hyaluronidaseblanding i en endelig konsentrasjon på 300 U/ml kollagenase og 100 U/ml hyaluronidase og plasser røret horisontalt i en 37 °C orbital inkuberende shaker i 30 minutter ved 200 o/min.
    5. Etter vevsfordøyelse, legg til et likt volum (5 ml) på 10% kull-strippet FBS i DPBS i røret og sentrifuger røret ved 200 x g i 5 minutter.
    6. Fjern og kast supernatanten. Tilsett 2 ml trypsin erstatning i cellepellet og bland godt. Sett røret i en celleinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 minutter.
    7. Etter inkubasjon, pipette opp og ned 10x med en standard P1000 spiss. Tilsett 5 ml 10 % kull-strippet FBS i DPBS.
    8. Sil de disassosierte cellene gjennom en 100 μm steril cellesil. Samle celle suspensjon og sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
  3. Telle og bruke celler på nytt
    1. Fjern og kast supernatanten. Resuspend cellepellet med 1 ml CCM.
    2. Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer og bare plate 0,5 x 106 celler i en brønn på en 24-brønns plate med 0,5 ml fersk CCM. På dette tidspunktet, ta ut matrise ekstrakter av Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom celler (se Tabell over materialer) fra -20 °C lagring og tine på is. Forvarm en 6-brønns plate i en 37 °C celleinkubator.
      MERK: De resterende cellene kan sentrifugeres og fryses som cellepellets for ikke-virustransduksjonskontroll.

3. Adenoviral transduksjon og plating organoider

FORSIKTIG: Vær forsiktig når du behandler adenovirus. Laboratoriepersonell bør følge biosikkerhet nivå 2 praksis og desinfisere adenovirus med 10% blekemiddel.

  1. Tilsett 2 μL adenovirus (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) i 24-brønnsplaten. Bland godt med de disassosierte urothelialcellene.
  2. For å forbedre transduksjonseffekten, utfør spinokulering ved å sentrifugere 24-brønnsplaten ved 300 x g i 30 minutter ved romtemperatur. Plasser 24-brønnsplaten i en celleinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time.
  3. Overfør celler og medium fra brønnen til et 15 ml rør og sentrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern og kast supernatanten, tilsett 50 μL CCM, og bland godt med cellene nederst.
  4. Tilsett 140 μL matriseekstrakt og bland forsiktig godt for å unngå luftbobler. Tilsett oppløsningen raskt i den forvarmede 6-brønnsplaten ved 50 μL/kuppel for å lage kupler for organoider.
  5. Overfør platen til en 37 °C inkubator med 5 % CO2 forsiktig og la kuplene størkne i 5 minutter. Vend 6-brønnsplaten opp-ned og fortsett størkning i ytterligere 25 minutter.
  6. Etter inkubasjon, tilsett 2,5 ml CCM til hver brønn og legg platen i en inkubator for organoidkultur.

4. Organoid culturing og passaging

  1. Bytt medium hver 3-4 dager. Utfør organoid culturing, passaging og frysing som rapportert i Lee et al.9. Utfør innebygging av organoider ved hjelp av prøvebehandlingsgel som beskrevet i Fujii et al.10.
  2. Fjern mediet og tilsett 1 ml dispase til hver brønn. Bryt kuppelen forsiktig og bland godt med en P1000 pipettespiss.
  3. Plasser platen i en inkubator på 37 °C med 5 % CO2 i 30 minutter. Samle deretter alle cellene i et 15 ml sentrifugerør og vask brønnen med 4 ml 10% kull-strippet FBS i DPBS. Hvis organoidcellene vises som store klynger, utfører du trinn 2.2.6. og trinn 2.2.7. for å få ikke-tilknyttede celler.
  4. Sentrifuger røret på 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og vask cellene med 1 ml CCM.
  5. Resuspend cellene i 70% matrise ekstrakt og følg trinn 3.4.-3.6. for dyrking. Alternativt kan kryopreservere cellene ved å resuspendere i 90% kull-strippet FBS og 10% DMSO supplert med 10 μM frisk Y-27632.

5. Organoidceller implantasjon i C57BL/6J mus subkutant

  1. Forberedelse for implantasjon
    1. Forbered 25G 1,5 i nåler, en 1 ml sprøyte, 1 mg / ml dispase, matriseekstrakt, 10% kull-strippet FBS i DPBS med 10 μM frisk Y-27632 og et 15 ml sentrifugerør.
  2. Organoid cellesamling
    1. Etter å ha oppnådd en stabil kultur i minst 5 passasjer, samle de utvidede organoidcellene for in vivo-injeksjon . Følg trinn 4.2.-4.4. og resuspendceller i 1 ml CCM.
  3. Telleceller og subkutan injeksjon
    1. Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer. Etter sentrifugering ved 200 x g i 5 min, resuspend 2 x 106 celler i 100 μL av 50% matrise ekstrakt i DPBS. Plasser suspensjonen på isen og ta den inn i et biosikkerhetsskap i et dyreprosedyrerom.
    2. Bedøv to mannlige C57BL/6J mus (10 uker gamle) med 4% isofluran og 1 L/min O2 strømning i ca. 4 min i et kammer. Når musene har mistet sin høyre refleks og pustemønsteret har blitt dypere og langsommere, overfør musene til en ikke-rebreathing krets med 2% isofluran og 1 L / min O2 strømning. Påfør veterinærsalve for å beskytte dyrenes øyne mot traumatisk skade.
    3. Barber ett område rundt injeksjonsstedet på musens høyre flanke og bruk 70% etanol for å rense, og bruk deretter en 25 G nål for å injisere 100 μL cellefjæringen direkte i høyre flanke under anestesi.
    4. Etter injeksjon, fjern inhalasjonsbedøvelsen og legg musene i et bur under en varmelampe til de gjenopprettes og mobiliseres fullt ut. Returner musene for boliger og overvåk tumordannelse.

6. Tumorkolleksjon og in vivo-forplantning

  1. Følg klargjøringen trinn 2.1.1. Euthanize mus ved CO 2-kvelning ved hjelp av en 2,0 l / min strømningshastighet etterfulgt av livmorhalsforskyvning etter en svulst på ~ 2,0 cm diameter (nesten 2-3 uker) dannes. Overfør musene til et rent disseksjonsområde, spray 70% etanol på musen flanke tumorområdet, og bruk steril disseksjon saks og tang for å gjøre et snitt for å skille svulsten.
  2. Vask svulsten i en 60 mm tallerken med 5 ml DPBS og bruk saks for å fjerne bindevevet. Klipp ett stykke av den friske svulsten og senk den med 4% paraformaldehyd i DPBS i 48 timer og send for parafininnbygging og seksjonering for histologianalyse.
  3. Behandle den andre halvdelen av den friske svulsten for celledisassosiasjon. Kort sagt, hakk den friske svulsten i 1 mm3 stykker for dissosiasjon i en 60 mm tallerken med 5 ml CCM (-). Deretter, etter å ha fulgt trinn 2.2.4.-2.2.8., injiser de ikke-assosierte cellene i nye C57BL/6J-mus for in vivo passaging etter trinn 5.3. eller hold som in vitro organoid kultur etter trinn 3.4.-3.6., eller fryse direkte i flytende nitrogen ved hjelp av 90% kull-strippet FBS og 10% DMSO med 10 μM frisk Y-27632.
  4. Om nødvendig, gjenopprette de frosne cellene ved å tine dem raskt i et 37 ° C vannbad og vask med CCM (-). Etter dette, resuspend dem i 100 μL av 50% matrise ekstrakt i DPBS for direkte injeksjon i mus for in vivo tumor formasjon. Bruk minst 2 x 106 opptinte celler for en in vivo-injeksjon .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbeidsflyten av adenovirus-Cre medierte genslettinger i museretthelialceller er vist i figur 1A. Den medfølgende videoen viser hvordan de urotheliale cellene er disassosiert fra blærens fundus og hvordan de tredoble floxed cellene transduseres ex vivo med Ad5CMVCre. Figur 1A viste at minimale submucosa- og muskelceller ble fjernet etter enzym fordøyelse. For å bekrefte effektiviteten av adenovirus-Cre-levering, ble disassosierte urothelialceller fra trippel floxed mus med membran-målrettet tdTomato / membranlokalisert forbedret grønt fluorescerende protein (mT / mG) transdusert med adenovirus Cre. Grønt fluorescerende protein (GFP) ble påvist i nesten 100% av cellene, noe som indikerer høy effektivitet av adenovirustransduksjon (figur 1B).

De stabile TKO-organoidene ble etablert etter standard organoidprotokoller (in vitro med mer enn 5 passasjer; Figur 2A). H&E og immunfluorescence (IF) av in vitro organoide seksjoner (figur 2A) viste en morfologi av høyverdig urothelialkarsinom med positivt uttrykk for urotheliale avstamning markører CK5 og p6311. PCR-analyse avdekket rekombinerte alleler i TKO-organoidene, mens ukombinerte floxed alleler bare ble påvist i urotelceller ubehandlet med adenovirus (figur 2B). Totalt ble 2 x 106 primære ex vivo organoider injisert i C57BL/6J for første subkutane (SQ) tumordannelse på 8 uker. Deretter ble SQ-svulst (passasje 1) samlet og passeret hos mus. Generelt var det nødvendig med 2-3 uker for å danne en 2 cm SQ-svulst (passasjer 2-5) (figur 2C). Immunhistokjemien (IHC) til TKO in vivo xenograft viste positivt uttrykk for CK7 (patchy), CK5 og p63 og negativt uttrykk for CK8 og Uroplakin 3 (figur 2D). For å oppdage forurensning av mesenchymeceller ble TKO-svulstene farget for vimentin. H&E flekk viste svulsten til venstre og kapselen til høyre avgrenset av den gule linjen. Positiv vimentin ble oppdaget bare i tumorkapselen eller stroma (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: Adenovirus-Cre formidlet gensletting i muserettingsceller med loxP-steder . (A) Arbeidsflyten av TKO organoid generasjon via ex vivo adenovirus Ad5CMVCre. En korttids 30 min enzym fordøyelse var tilstrekkelig til å disassosiere urothelial celler fra underliggende submucosa og muscularis propria. De disassosierte urotelceller ble transdusert med Ad5CMVCre for TKO organoider og deretter injisert i C57BL / 6J mus. (B) Trippel floxed urothelial celler med mT / mG (konstituerende transgene uttrykk for rødt fluorescerende protein som omdannes til grønt fluorescerende protein etter Cre rekombinasjon) ble transdusert med Ad5CMVCre. Nesten 100% av cellene var GFP-positive, noe som indikerer svært effektiv transduksjon og Cre-rekombinasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av TKO-organoider via ex vivo adenovirus-Cre-rekombininase. (A) De ikke-assosierte Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f urothelialceller ble transdusert med adenovirus (Ad5CMVCre) for å generere TKO-organoider (lysfelt). TKO-organoidene ble innebygd med prøvebehandlingsgel og farget for H&E og immunfluorescens. (B) Genomisk DNA ble ekstrahert fra trippel floxed urothelial celler (lane 2) og TKO organoider (lane 4) og forsterket av PCR for å oppdage floxed alleler eller Cre recombined alleles av Trp53, Rb1, og Pten. PCR-bånd ble farget med ethidiumbromid. Bane 1 og bane 3 var negative og positive rekombinerte kontroller. (C) En brutto TKO SQ tumor (passasje 4) ble vist på dag 17 etter SQ injeksjon. (D) Tumorvevsseksjoner fra TKO SQ xenografts ble farget med H&E, IF (CK5, CK8) eller IHC (CK7, p63, Upk3). Forkortelser: CK5 = Cytokeratin 5; CK20 = Cytokeratin 20; CK8 = Cytokeratin 8; CK7 = Cytokeratin 7; Upk3 = Uroplakin III. (E) Tumorvevsseksjoner fra TKO SQ xenografts ble farget med H&E og IF (vimentin). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GEMMs har vært gullstandardene for kreftmodellering initiert fra normale celler, slik at konsekvensene av potensielle onkogene perturbasjoner (oncogene aktivering og / eller tap av tumordempere) kan testes grundig. Her gis en rask og effektiv protokoll for å generere blærekreftorganoider via ex vivo genredigering av normale mus urothelialceller som bærer floxed alleler i gener av interesse. H&E- og IHC-farging viser at TKO-organoider viser histologi i samsvar med høyverdig urothelial urothelium, med squamous differensiering og en basallignende undertype både som in vitro organoider og som in vivo xenografts. TKO organoider kan brukes in vitro for å studere effekten av Trp53, Rb1, og Pten tap, narkotika screening, og molekylær vurdering av signalveier. Rask tumordannelse hos C57BL/6J-mus vil muliggjøre in vivo-studier designet for å evaluere behandlingsresponser på systemiske terapier som kjemoterapi eller immunterapi.

Urothelium består av et lag basale celler (positivt for CK5 og p63), 1-2 lag mellomliggende celler (Uroplakins og p63 positive), og paraplyceller (Uroplakins, CK8 og CK20 positive)6. Et kritisk skritt i metoden er den begrensede tiden (30 min) av vevsdisassosiasjon i stedet for en langvarig (4 timer) enzym fordøyelse, noe som tillater minimal forurensning av ikke-urotheliale submucosa celler (figur 1A). En lengre oppløsingstid kan øke prosentandelen av stromale celler, for eksempel endotelceller og fibroblasterceller. Ex vivo transduksjon trinn av adenovirus er svært effektiv. Etter eks vivo adenovirus Cre-transduksjon ble GFP visualisert i nesten 100% av urotelceller med mT/ mG reporter alleler (figur 1B).

Det er begrensninger i ex vivo-metoden. For det første er de ikke-assosierte cellene ikke forhåndsvalgt før adenovirustransduksjon. Celler differensieres for eksempel ikke urotelceller kontra ikke-urotelceller, eller lysceller kontra basale celler. Cellesortering med EpCAM og/eller CD49f kan brukes til å sortere rene epitelceller og/eller stamceller før ex vivo-transduksjon 12,13. For det andre retter adenoviruset Cre-uttrykket med CMV-promotor som brukes i denne protokollen, mot et bredt spekter av celletyper etter vevsdisassosiasjon (urothelial vs. ikke-urothelial, basal vs. lysceller). Denne ikke-spesifikke målrettingen kan føre til en utvalgsbias som forårsaker overvekst av celler med mest onkogent potensial. Celletypespesifikke adenovirusvektorer har blitt brukt topisk i både lungekreft og blærekreft GEMMs 14,15,16,17. Fremtidige studier ved hjelp av ex vivo celle type-spesifikk adenovirus (adenovirus med en CK8 promotor eller en CK5 promotor) kan ta opp cell-of-origin spørsmål om TKO organoider er avledet fra basal eller luminal celler18. CK20 eller Upk2 promotorspesifikk adenovirus (ikke tilgjengelig for vår kunnskap) kan også utformes for å transdusere paraplyceller i urotheliumet. Imidlertid er fremtidige studier nødvendig for å undersøke effektiviteten og spesifisiteten til disse promotorspesifikke adenovirusene for ex vivo blæreinfeksjon. Det kan være et avvik i adenovirus-Cre effektivitet mellom in vivo og ex vivo transduksjon på grunn av vertsmiljøet18. For det tredje er ex vivo-metoden begrenset av mangel på tumormiljø, noe som kan påvirke in vivo tumorigenesis og histomorfologi. Til tross for disse begrensningene er en stor fordel med ex vivo-metoden den raske arbeidsflyten (1-2 uker i stedet for år med museavl). Den andre fordelen med ex vivo-tilnærmingen er at adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) er kommersielt tilgjengelig, grei og nesten 100% effektiv for viral transduksjon og Cre-rekombinasjon (figur 1B). I motsetning krever alternative ex vivo-metoder ved hjelp av CRISPR-redigering eller lentiviral transduksjon ytterligere klonevalg på grunn av mindre effektiv genomisk redigering 5,13,19,20.

Oppsummert er ex vivo adenovirustilnærmingen beskrevet praktisk, rask og effektiv i å generere blærekreftmodeller ved hjelp av en hvilken som helst kombinasjon av gener av interesse (floxed alleles) relatert til human blærekreft. Disse modellene kan kombineres med celletypespesifikk adenovirus og cellesortering for å adressere virkningen av opprinnelsescellen på blærekreftfenotype og for å evaluere behandlingsresponser på immunterapier i en setting av definerte genetiske mutasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette forskningsarbeidet ble delvis støttet av NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μm sterile cell strainer Corning 431752
1 mL syringe BD 309659
25G 1.5 inches needle EXELINT International 26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) UI Viral Vector Core VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J Jackson Lab 000664
Charcoal-stripped FBS Gibco A3382101
Collagenase/hyaluronidase Stemcell Technologies 07912
Dispase Stemcell Technologies 07913
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX) Gibco 35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium Lonza CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) Corning CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20 DAKO M7019 IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7 Santa Cruz Biotechnology SC-23876 IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63 Abcam ab735 IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3 Fitzgerald 10R-U103A IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin Santa Cruz Biotechnology SC-6260 IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-s IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator Thermo Fisher 51033557
Polyclonal chicken anti-CK5 Biolegend 905901 IF 1:500
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher 12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 VWR 35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel) Thermo Fisher HG-4000-012
Surgical blade size 10 Integra Miltex 4-110
Sorvall Legend RT Thermo Fisher 75004377
Sorvall T1 centrifuge Thermo Fisher 75002383
Y-27632 Selleckchem S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
  2. Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
  3. DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
  4. Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
  5. Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
  6. Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
  7. Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
  8. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  9. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  10. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
  11. Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
  12. Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
  13. Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
  14. Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
  15. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  16. Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
  17. Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
  18. Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
  19. Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
  20. Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).

Tags

Kreftforskning utgave 183
<em>Eks Vivo</em> Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K.,… More

Xu, D., Wang, L., Wieczorek, K., Wang, Y., Zhang, X., Goodrich, D. W., Li, Q. Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells. J. Vis. Exp. (183), e63855, doi:10.3791/63855 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter