Étudier les facteurs d’antirécompense dans le comportement de dépendance avec des méthodes d’expression génique unicellulaire anatomiquement spécifiques
Summary
La combinaison de la microdissection par capture laser et de la RT-qPCR microfluidique fournit une spécificité anatomique et biotechnique dans la mesure du transcriptome dans les neurones individuels et la glie. L’application de méthodes créatives avec l’approche biologique d’un système à la maladie psychiatrique peut conduire à des percées dans la compréhension et le traitement telles que l’hypothèse de la neuroinflammation antirécompense dans la dépendance.
Abstract
L’augmentation des taux de comportement de dépendance a motivé les chercheurs en santé mentale et les cliniciens à comprendre l’antirécompense et le rétablissement. Cet éloignement de la récompense et du commencement nécessite de nouvelles perspectives, paradigmes et hypothèses, ainsi qu’une expansion des méthodes appliquées pour étudier la dépendance. Ici, nous fournissons un exemple: Une approche de biologie des systèmes pour étudier l’antirécompense qui combine la microdissection par capture laser (LCM) et les réactions quantitatives en chaîne par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR). La dynamique du réseau d’expression génique a été mesurée et un facteur clé de la dysrégulation neuroviscérale dans le sevrage de l’alcool et des opioïdes, la neuroinflammation, a été identifié. Cette combinaison de technologies fournit une spécificité anatomique et phénotypique à une résolution unicellulaire avec une sensibilité à haut débit et des mesures d’expression génique spécifiques produisant à la fois des ensembles de données génératrices d’hypothèses et des possibilités mécanistes qui génèrent des opportunités pour de nouvelles connaissances et de nouveaux traitements.
Introduction
La dépendance reste un défi croissant dans le monde développé 1,2. Malgré des avancées scientifiques et cliniques majeures, les taux de dépendance continuent d’augmenter tandis que l’efficacité des traitements établis reste stable aumieux3,4,5. Cependant, les progrès de la biotechnologie et des approches scientifiques ont conduit à de nouvelles méthodes et hypothèses pour étudier plus avant la physiopathologie de la dépendance aux substances 6,7,8. En effet, les développements récents suggèrent que de nouveaux concepts et paradigmes de traitement peuvent conduire à des percées avec des conséquences sociales, économiques et politiques 9,10,11,12.
Nous avons étudié l’antirécompense dans le sevrage de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes13,14,15,16. Les méthodes sont au cœur de ce paradigme17,18. La microdissection par capture laser (LCM) peut sélectionner des cellules individuelles avec une spécificité anatomique élevée. Cette fonctionnalité fait partie intégrante de l’hypothèse antirécompense de la neuroinflammation, car la glie et les neurones peuvent être collectés et analysés à partir du même sous-noyau neuronal chez le même animal 13,14,15,16,19. Une partie pertinente du transcriptome de cellules sélectionnées peut ensuite être mesurée avec des réactions en chaîne quantitatives par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR) fournissant des ensembles de données de grande dimension pour l’analyse informatique donnant des informations sur les réseaux fonctionnels20,21.
La mesure d’un sous-ensemble du transcriptome dans les neurones et la glie dans un noyau cérébral spécifique génère un ensemble de données robuste à la fois en nombre d’échantillons et en gènes mesurés, sensible et spécifique. Ces outils sont optimaux pour l’approche neuroscience d’un système à la maladie psychiatrique parce que la glie, principalement les astrocytes et la microglie, ont démontré un rôle central dans les maladies neurologiques et psychiatriques au cours de la dernière décennie22,23. Notre approche permet de mesurer la réponse expressive de la glie et des neurones de manière concomitante à travers de nombreux récepteurs et ligands impliqués dans la signalisation paracrine locale. En effet, la signalisation peut être déduite de ces ensembles de données en utilisant diverses méthodes quantitatives telles que la logique floue24. En outre, l’identification des sous-phénotypes cellulaires dans les neurones ou la glie et leur fonction peut fournir un aperçu de la façon dont les cellules cérébrales dans des noyaux spécifiques s’organisent, répondent et dérégulent au niveau de la cellule unique. La dynamique de ce système fonctionnel peut également être modélisée à l’aide d’expériences de séries chronologiques16. Enfin, les modèles animaux peuvent être perturbés anatomiquement ou pharmacologiquement pour donner une condition mécaniste à l’approche de ce système.
Expérience représentative :
Ci-dessous, nous fournissons un exemple de l’application de ces méthodes. Cette étude a examiné l’expression des gènes neuronaux et microgliaux du rat dans le noyau solitaire (SNT) en réponse à la dépendance à l’alcool et au sevrage subséquent16. Les cohortes de rats comprenaient 1) le groupe témoin, 2) l’éthanol-dépendant (EtOH), 3) le retrait de 8 h (Wd), 4) 32 h Wd et 5) 176 h Wd (figure 1A). Après une décapitation rapide, les troncs cérébraux ont été séparés du cerveau antérieur et cryosectionnés, et des tranches ont été colorées pour les neurones tyrosine hydroxylase positive (TH +) et la microglie (Figure 1B). La LCM a été utilisée pour collecter à la fois les neurones TH+ et TH- et la microglie. Toutes les cellules provenaient du SNRC et ont été analysées comme des échantillons de pools de 10 cellules. Quatre réseaux dynamiques RT-qPCR microfluidiques de 96 x 96 ont été exécutés sur la plateforme RT-qPCR mesurant 65 gènes (Figure 1B-C). Les données ont été normalisées à l’aide d’une méthode -ΔΔCt et analysées à l’aide de R, et la sélection d’une cellule unique a été validée avec des marqueurs moléculaires (Figure 1D-E). La validation technique a ensuite été vérifiée par des répliques techniques analysées au sein d’un seul lot et entre les lots (figure 2 et figure 3). Les neurones TH+ et TH- sont organisés en différents sous-phénotypes avec des groupes de gènes inflammatoires similaires, mais des groupes de récepteurs (R) de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) différents (Figure 4 et Figure 5). Les sous-phénotypes qui avaient une expression élevée des groupes de gènes inflammatoires étaient surreprésentés à 32 h Wd, tandis que l’expression du récepteur GABA (GABAR) restait faible dans le sevrage prolongé de l’alcool (176 h Wd). Ces travaux contribuent à l’hypothèse antirécompense de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes qui conjecture que la rétroaction interceptive des viscères en sevrage contribue à la dérégulation des noyaux neuronaux viscéraux-émotionnels (c.-à-d. SNT et amygdale) entraînant des séquelles autonomes et émotionnelles plus graves, qui contribuent à la dépendance aux substances (Figure 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le trouble lié à la consommation d’alcool demeure une maladie difficile à traiter. Notre groupe a abordé ce trouble en étudiant les processus antirécompense dans une perspective de neuroscience des systèmes. Nous avons mesuré les changements d’expression génique dans les neurones SNT simples et la microglie dans une série de temps de sevrage alcoolique16. Le SNT a été choisi pour son rôle de premier plan dans la dysrégulation autonome qui se produit dans le syndrome de sevrage al…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail présenté ici a été financé par NIH HLB U01 HL133360 attribué à JS et RV, NIDA R21 DA036372 attribué à JS et EVB, T32 AA-007463 attribué à Jan Hoek à l’appui de SJO, et National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
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