Summary
야생형 원숭이로부터 얻은 망막 외식편을 시험관 내에서 배양하였다. 망막 변성 및 cGMP-PKG 신호전달 경로는 PDE6 억제제 zaprinast를 사용하여 유도하였다. 상이한 자프리나스트 농도에서 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광법을 사용하여 검증하였다.
Abstract
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 합니다. 광수용체 세포에서 고리형 구아노신 일인산(cGMP) 의존성 단백질 키나아제(PKG) 경로의 과활성화는 특히 포스포디에스테라제 6b(PDE6b) 돌연변이가 있는 모델에서 광수용체 세포 사멸을 유발합니다. RD에 대한 이전 연구에서는 주로 rd1 또는 rd10 마우스와 같은 쥐 모델을 사용했습니다. 생쥐와 인간의 유전 적, 생리 학적 차이를 감안할 때, 영장류와 설치류의 망막이 어느 정도 비슷한지를 이해하는 것이 중요합니다. 원숭이는 인간과 높은 수준의 유전적 유사성을 공유합니다. 따라서 망막-망막 색소 상피(RPE)-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 야생형 원숭이(1-3세)를 선택했습니다. 이들 외식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하고 RD 병인을 시뮬레이션하였다. 영장류 망막 외식편에서의 cGMP 축적 및 세포 사멸은 후속적으로 면역형광 및 TUNEL 분석을 사용하여 검증하였다. 이 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 RD의 메커니즘에 대한 적절하고 효과적인 연구와 향후 치료 접근법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하며 다양한 병원성 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다1. RD의 최종 결과는 시력 상실이며 대부분의 경우 질병은 오늘날까지 치료할 수 없습니다. 따라서, 인간의 질병 상태를 충실하게 나타내는 모델을 사용하여 광수용체 사멸로 이어지는 세포 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다. 여기서 영장류 기반 모델은 인간과의 친밀감 때문에 특히 중요합니다. 특히, 이러한 모델은 광수용체 세포 사멸을 중단시키거나 지연시킬 수 있는 적절한 치료 개입의 개발을 진전시킬 수 있습니다.
RD의 세포 사멸 메커니즘에 대한 이전 연구에서는 RD 유발 유전자 돌연변이로 인한 포스포디에스테라제 6(PDE6) 활성의 감소 또는 손실이 고리형 구아노신 일인산(cGMP)의 가수분해를 감소시킨다는 것을 입증했습니다.2,3. cGMP는 막대 바깥쪽 세그먼트(ROS)에 있는 고리형 뉴클레오티드 개폐 이온 채널(CNGCs)의 특이적 작용제이며, 척추동물 광수용체 세포에서 광 신호를 전기 신호로 변환하는 역할을 하는 핵심 분자이기도 하다4. cGMP 가수 분해가 감소하면 ROS에 cGMP가 축적되어 CNGC가 개방된다 5. 결과적으로, 광변환 경로가 활성화되어 광수용체 세포에서 양이온 농도가 증가합니다. 이 과정은 광수용체에 대사 부담을 부과하며, 예를 들어 PDE6의 돌연변이에 의해 과잉 활성화되면 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.
많은 연구에서 RD 유전자 돌연변이가 다른 마우스 모델의 광수용체에서 cGMP의 상당한 과다 축적이 cGMP 의존성 단백질 키나아제(PKG)의 활성화를 유발할 수 있음을 보여주었습니다3,6. 이것은 죽어가는 TUNEL 양성 세포의 상당한 증가와 광수용체 세포층의 점진적인 얇아짐으로 이어집니다. 이전의 연구들은 상승된 cGMP 수치에 의한 PKG 과잉활성화가 광수용체 세포사멸의 유도를 위한 필요충분조건임을 시사한다 2,5. RD의 상이한 마우스 모델에 대한 연구는 또한 광수용체에서 상승된 cGMP 수준에 의해 유도된 PKG 활성화가 폴리-ADP-리보스 중합효소 1 (PARP1), 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 및 칼파인 2,7,8,9와 같은 다운스트림 이펙터의 과활성화를 유도한다는 것을 보여주었다. 이것은 이러한 서로 다른 표적 단백질과 광수용체 세포 사멸 사이의 인과 관계를 의미합니다.
그러나 RD의 병리학, 독성 약리학 및 치료에 대한 이전 연구는 주로 RD10,11,12에 대한 마우스 모델을 기반으로 했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과의 임상 번역에는 엄청난 어려움이 남아 있습니다. 이것은 특히 망막 구조와 관련하여 생쥐와 인간 사이의 상당한 유전적, 생리학적 차이 때문입니다. 대조적으로, 비인간 영장류(NHP)는 유전적 특성, 생리학적 패턴 및 환경 요인 조절과 관련하여 인간과 높은 수준의 유사성을 공유합니다. 예를 들어, 광유전학적 요법은 NHP 모델13에서 망막 활성을 회복시키는 수단으로서 조사되었다. Lingam과 동료들은 우수 제조 관행 등급의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 망막 광수용체 전구체 세포가 NHP14에서 원추형 광수용체 손상을 구제할 수 있음을 입증했습니다. 따라서 NHP 모델은 RD 발병기전의 탐색과 효과적인 치료 방법의 개발에 중요합니다. 특히, 인간과 유사한 병원성 기전을 나타내는 RD의 NHP 모델은 신약의 개발 및 생체 내 독성 약리학 분석에 대한 연구에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.
긴 수명 주기, 높은 수준의 기술적 어려움 및 생체 내 영장류 모델 구축과 관련된 높은 비용을 고려하여 이식된 원숭이 망막의 배양을 사용하여 시험관 내 비인간 영장류(NHP) 모델을 확립했습니다. 먼저, 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 1-3세의 야생형 원숭이를 선택했습니다. 이어서, 체외이식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트(100 μM, 200 μM 및 400 μM)로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하였다. 광수용체 세포 사멸은 TUNEL 분석을 사용하여 정량화 및 분석하였으며, 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광을 통해 검증하였다. 원숭이와 인간 사이의 세포 분포 및 형태, 망막층 두께 및 망막의 기타 생리학적 특성과 관련하여 높은 수준의 유사성을 감안할 때, 시험관 내 망막 모델에서 cGMP-PKG 신호 전달 경로의 확립은 RD의 발병기전에 대한 향후 연구뿐만 아니라 RD 치료를 위한 신약의 개발 및 독성 약리학에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물 연구는 중국과학원 동물학 연구소 윤리 검토 위원회(IACUC-PE-2022-06-002)와 윈난대학교 동물 윤리 검토 및 동물 프로토콜(YNU20220149)의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 망막 체외이식편의 제조
- 1세에서 3세 사이의 야생형 원숭이에서 영장류 안구를 채취하여 조직 저장 용액에 보관하고 원숭이를 희생시킨 후 또는 자연사 후 적출 후 3시간 이내에 얼음 위에서 운반합니다.
- 프로테이나제 K 용액의 제조를 위해, 25 μL의 증류수에 25 μL의 프로테이나제 K를 용해시킨 후, 225 μL의 용액을 18.5 mL의 기초 배지 (R16)에 첨가한다.
- 5% 포비돈 요오드(포비돈 요오드: 물 = 1:19) 10mL에 안구를 30초 동안 씻고 5% 페니실린/스트렙토마이신(PEN/STREP):p호스페이트 완충 식염수 = 1:19에 1분 동안 담가 박테리아 오염을 방지합니다. 그런 다음 10mL의 R16 배지에서 5분 동안 안구를 배양합니다.
- 프로테이나제 K 용액을 37°C 인큐베이터에서 예열한다. 그런 다음 안구를 10mL의 프로테이나제 K 용액에 담그고 2분 동안 배양합니다. 안구를 R16 + 소 태아 혈청(1:1) 용액 10mL에 담그고 5분 동안 배양한 다음 최종 세척을 위해 안구를 신선한 R16 10mL로 옮깁니다.
- 공막, 각막, 홍채, 수정체, 유리체를 분리하고 핀셋과 가위로 4면에서 망막을 자릅니다(그림 1A-L).
- 트레핀 블레이드가 있는 망막 체외이식편을 비강/측두엽/상부/하측을 위한 4mm 트레핀 블레이드와 중앙 사이드를 위한 6mm 트레핀 블레이드(시신경 디스크 및 황반 포함; 그림 1M-O). 시신경두에서 다음 거리에서 절단합니다: 비강 1.5mm, 측두부 4mm, 상부 및 하부 2mm.
- 눈꺼풀 압착기로 망막 외식편(망막 및 맥락막 포함)을 옮기고 삽입물 중앙에 광수용체 쪽이 위로 향하게 놓습니다(그림 1P). 약 1mL의 완전 배지(BSA, 트랜스페린, 프로게스테론, 인슐린, T3, 코르티코스테론, 비타민 B1, 비타민 B12, 레티놀, 레티닐 아세테이트, DL-토코페롤, 토코페릴 아세테이트, 리놀레산, L-시스테인 HCl, 글루타티온, 글루타민, 비타민 C)를 플레이트의 막 아래에 놓아 망막을 완전히 덮습니다.
2. 영장류 망막 체외이식편 배양
- 망막 체외이식편을 완전 배지에서 배양하고, 가습된 5%CO2로 통기된 37°C 인큐베이터에 넣는다.
- 망막 배양 배지에 적절한 농도로 약물 처리를 적용합니다(예: 100μM, 200μM 또는 400μM 농도의 자프리나스트). 치료 조건당 최소 3개의 외식편을 사용하고 약물 없이 외식편을 대조군으로 사용하십시오. 4 일 동안 약으로 치료하십시오.
3. 고정 및 냉동 절편
- 망막 체외이식편을 파라포름알데히드(PFA) 1mL와 함께 45분 동안 배양하고 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 잠시 헹군 다음 10% 자당으로 10분, 20% 자당으로 20분, 30% 자당으로 30분 동안 배양합니다(각 망막 체식편당 1mL).
- 트레핀 블레이드를 사용하여 망막 외식편을 절단하여 다음과 같은 특성을 가진 다른 부위에서 얻은 외식편 크기의 일관성을 보장합니다: 주변에 4개의 사분면, 중앙에 6mm. 그런 다음 망막 외식편을 조직을 덮기 위해 OCT 포매 배지가 있는 틴박스(약 1.5cm x 1.5cm x 1.5cm)로 옮깁니다. 즉시 조직 절편을 액체 질소로 얼리고 -20°C 냉장고에 보관합니다.
- 날카로운 칼날을 사용하여 한천을 조직 샘플이 들어 있는 작은 블록으로 자르고 샘플 블록을 10μm 섹션으로 자른 다음 부드러운 브러시를 사용하여 접착 현미경 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 40°C에서 45분 동안 건조하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
4. 면역조직화학(그림 2)
- cGMP 염색
- 슬라이드를 건조시키고 액체 차단제 펜으로 망막 부분 주위에 소수성 고리를 그려 샘플을 덮습니다.
- 슬라이드를 0.3% 인산염 완충 식염수 200μL와 슬라이드당 Triton X-100(PBST)에 실온에서 10분 동안 담근 다음 블로킹 용액(5% 일반 당나귀 혈청, 0.3% PBST, 1% BSA, 슬라이드당 200μL)에 실온에서 1시간 동안 담급니다.
- 4°C에서 블로킹 용액에 준비된 1차 항체(1:250, 양 항-cGMP, 슬라이드당 200μL)와 함께 샘플을 밤새 배양한 다음 PBS로 10분(슬라이드당 200μL) 3x 헹굽니다.
- 시료를 2차 항체(1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 슬라이드당 200μL)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 10분, 3배 동안 헹굽니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유한 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 덮고 이미징 전에 최소 30분 동안 4°C에서 보관합니다.
- TUNEL 염색
- 슬라이드를 실온에서 15분 동안 건조시키고 액체 차단제 펜으로 망막 조직 표본 주위에 발수 장벽 링을 그린 다음 40mL의 PBS에서 15분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 37°C에서 42 mL(슬라이드 5개당)의 TBS(0.05 M Tris-buffer)로 인큐베이션한다. TBS를 흡인하고 5분 동안 6μL의 프로테이나제 K로 샘플을 배양합니다. 그런 다음 매번 5분 동안 TBS로 슬라이드를 3번 세척합니다.
- 슬라이드를 초플린의 에탄올-아세트산 용액 40mL에 노출시키고, 투명 시트로 덮고, -20°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 매번 TBS로 슬라이드를 3분 동안 5번 세척합니다.
- 슬라이드를 차단 용액(1% BSA, 요구 사항에 따라 슬라이드당 200-300μL)에 노출시키고 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
- 62.50 μL의 차단 용액(1% BSA), 56.25 μL의 표지 용액(TMR-dUTP) 및 6.25 μL의 효소(각 슬라이드에 대한 비율)의 비율로 TUNEL 키트 용액인 TMR 빨간색을 준비합니다. 슬라이드당 약 130μL의 이 용액을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 5분 동안 2배 세척한다(슬라이드 당 200 μL).
- 샘플 위에 DAPI와 함께 페이드 방지 장착 배지 1-2방울이 포함된 커버 슬라이드를 놓은 다음 이미징 전에 슬라이드를 4°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.
- TUNEL 염색과 결합된 cGMP 염색
- cGMP 염색에 이어 TUNEL 염색을 하였다. 단계 4.2.1에서 단계 4.2.5까지 TUNEL 염색 단계를 수행한 다음, 단계 4.1.2에서 단계 4.1.4로 cGMP 염색 단계를 계속한다.
- 다음과 같이 카메라 파라미터를 사용하여 광 및 형광 현미경 검사를 수행합니다: 노출 시간 = 125ms, ROI 크기 = 2752 x 2208, 색상 = B/M. 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 각 섹션에서 20x 배율의 디지털 카메라로 4개의 다른 필드를 촬영하고 DAPI(465nm), EGFP(509nm), TMP(578nm)를 사용하여 망막의 중앙 영역에서 대표 사진을 얻습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구에서는 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 외식편을 사용하여 원숭이 원숭이 망막 외식편 배양을 수행했습니다(그림 1, 보충 그림 S1). 부착된 RPE 및 맥락막이 없는 망막을 사용하는 망막 세포의 시험관 내 배양과 비교할 때, 당사의 체외이식편 배양은 더 나은 세포 생존을 촉진하고 따라서 광수용체 세포의 생존을 연장합니다.
우리는 PDE6 억제제 zaprinast(100 μM, 200 μM 및 400 μM; 보충 그림 S2) 광수용체에서 cGMP의 축적 및 시험관 내에서 PKG의 후속 활성화를 유도합니다. 각 농도 처리는 각각 4일 동안 주어졌다. 시험 관내 망막 모델을 400 μM 자프리나스트로로 처리한 결과, 가장 많은 수의 TUNEL 양성 세포, 상당한 cGMP 신호 및 내부 망막의 RPE 및 신경 세포에 대한 낮은 독성이 나타났다. 그림 2 에서 TUNEL 양성 세포의 높은 비율은 cGMP 활성의 증가가 zaprinast에 의해 유도된 망막 세포 변성을 향상시킬 수 있으며 cGMP 축적이 광수용체 변성에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이 연구에서 확립된 원숭이 망막 변성 모델은 cGMP-PKG 의존성 RP의 메커니즘에 대한 포괄적인 조사에 도움이 될 것입니다.
그림 1: 1년 된 원숭이에서 배양한 망막 외식편의 생산 과정. (A-L) 공막체, 각막체, 홍채체, 수정체, 유리체를 분리하고 핀셋과 가위로 망막의 4면을 자릅니다. (모) 트레핀 블레이드가 있는 망막 체외이식편을 비강/측두엽/상부/하측을 위한 4mm 트레핀 블레이드와 중앙 사이드를 위한 6mm 트레핀 블레이드(시신경 디스크 및 황반 포함)의 5개 섹션으로 자릅니다. (P) 나비 모양의 망막 외식편(망막 및 맥락막 포함)을 멤브레인으로 옮기고 멤브레인을 6웰 배양 플레이트에 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 1세 원숭이의 망막 외식편 ONL 내 cGMP 활성 평가. 체외이식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트(100 μM, 200 μM, 및 400 μM)로 처리하였다. 3가지 상이한 농도에서 TUNEL(적색) 및 cGMP(녹색) 양성 세포의 수는 대조군(A-D)과 비교하였을 때 ONL에서 강하게 증가하였다. 대조군과 비교하여 TUNEL/cGMP 양성 세포는 100μM, 200μM 및 400μM 그룹에서 상당한 차이가 있습니다. 핵은 DAPI(청색)로 염색하였다. 400μM 자프리나스트로 처리된 망막의 영역을 확대하여 cGMP(녹색) 및 TUNEL(빨간색) 양성 세포 단독과 병합된 이미지를 관찰했습니다. 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타냅니다. * = p ≤ 0.05; ** = p ≤ 0.01; = p ≤ 0.001; = p ≤ 0.0001입니다. 약어: GC = 신경절 세포, INL = 내부 핵층, ONL = 외부 핵층, RPE = 망막 색소 상피, cGMP = 고리형 구아노신 일인산, PDE6 = 포스포디에스테라제 6. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 체외이식편 배양에 사용되는 망막 펀치의 위치. 비강 펀치에서 파생된 외식편은 시신경두에서 1.5mm 떨어진 곳에 위치했으며, 이 거리는 측두엽의 경우 4mm, 상부 및 하부 펀치의 경우 각각 2mm였습니다. 망막 외식편은 비강/측두엽/상부/하측을 위한 4mm 트레핀 블레이드와 중앙 사이드(시신경 디스크 및 황반 포함)를 위한 6mm 트레핀 블레이드의 5개 위치에서 트레핀 블레이드로 절단하여 얻었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 죽어가는 세포에 대한 TUNEL 염색. 대조군 망막(A) 및 100μM, 200μM 또는 400μM(B-D)의 농도에서 Zaprinast로 처리된 망막. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
시각적 광변환은 눈의 망막 내에 있는 광수용체 세포에 의해 광 신호가 전기 신호로 변환되는 생물학적 과정을 말합니다. 광수용체 세포는 광변환이 가능한 편광 뉴런이며, 외부 세그먼트의 모양을 따서 간상체와 원뿔이라고 하는 두 가지 유형의 광수용체가 있습니다. 막대는 scotopic 시력을 담당하고 원뿔은 사진 및 고시력 시력을 담당합니다. 유전성 RD는 진행성 망막 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환과 관련이 있다15.
RD에 대한 현재 연구는 주로 쥐 RD 모델에서 유래한 시험관 내 망막 체외이식편 배양을 포함하여 RD의 마우스 모델을 기반으로 하고 있다16. 그러나 생쥐와 인간 사이에는 특히 망막 구조에서 상당한 유전적, 생리학적 차이가 존재합니다. 대조적으로, NHP는 인간과 높은 수준의 유사성을 공유하므로 NHP 모델은 RD 병인 및 치료 개발 조사에 가장 적합합니다.
이 연구에서 우리는 원숭이의 망막 외식편을 배양하여 시험관 내 NHP 모델을 확립했습니다. 일상적인 단세포 일차 배양 및 불멸화된 세포주의 시험관 내 배양과 비교할 때, 시험관 내 망막 체외이식편 배양은 망막 조직 형태 및 세포간 상호작용을 보존할 수 있어 생체 내 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한, 사용되는 동물의 수를 크게 줄이고 실험 기간을 단축시키며, 망막 발달 또는 변성과 관련된 다양한 요인의 영향을 조사하기 위한 비교적 제어 가능한 실험적 접근법을 제공합니다.
망막 외식편의 성공적인 준비는 시험관 내 망막 모델의 성공적인 확립에 매우 중요합니다. 생쥐를 위한 망막 외식편 준비에 대한 이전 연구 경험을 바탕으로 원숭이 망막 외식편 준비를 위한 몇 가지 핵심 사항을 요약합니다.
1) 이식편 준비는 동물 희생 및 적출 후 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. 체외이식편 준비에 사용하기 전에 안구 보관을 위한 조직 저장 용액을 사용하는 것이 인산염 완충 식염수에 비해 세포 생존율을 더 잘 유지할 수 있으므로 권장됩니다.
2) 원숭이 안구의 크기가 크고 장기간 외부 환경에 노출되는 것을 고려할 때 망막 외식편을 준비하기 전에 희석된 포비돈 요오드포어와 이중 항생제 용액으로 안구를 세척하면 오염을 줄일 수 있습니다. 그러나 너무 오랜 시간 동안 세탁을 해서는 안 됩니다. 체외이식편 배양 중에 항생제를 첨가하는 것은 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있으므로 권장하지 않습니다.
3) 적출된 안구를 공막, 각막, 홍채, 수정체, 유리체를 순차적으로 분리한 후 망막을 절단합니다. 작고 공막과 포도막이 서로 밀착되어 있는 쥐의 안구와 달리 원숭이 안구는 상대적으로 크고 단단한 공막과 맥락막상 공간을 가지고 있습니다. 따라서 공막의 분리에는 가위가 필요합니다. 이것은 적출된 원숭이 안구를 다루는 데 어려운 단계는 아니지만 망막과 포도막이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 또한, 원숭이 렌즈의 거친 서스펜스 인대는 렌즈를 조심스럽게 제거하기 전에 가위로 절단해야 합니다. 유리체의 분리는 원숭이 눈의 큰 유리체, 유리체의 높은 점도 및 1-3 세 원숭이의 망막과 유리체의 단단한 부착으로 인해 체외이식편 준비 과정에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나입니다. 유리체는 가위를 사용하여 가능한 한 최대한 제거되었고, 망막 외식편의 후속 이식 및 배양을 용이하게 하기 위해 피펫을 사용하였다. 우리는 현재 유리체 제거를 위한 더 빠르고 효과적인 방법을 모색하는 과정에 있습니다. 망막 외식편(5mm)은 트레핀 블레이드를 사용하여 절단하여 서로 다른 부위에서 얻은 외식편 크기의 일관성을 보장했습니다(부위 특성: 주변에 4개의 사분면, 중앙에 6mm). 체외이식편을 배양 삽입물로 옮기는 동안 망막과 맥락막이 분리될 수 있습니다. 따라서 반복적인 시도가 망막 손상을 유발할 수 있으므로 첫 번째 시도 자체에서 외식편이 옮겨지도록 부드럽고 민첩한 취급이 필요합니다. 마지막으로, 망막 구조의 손상을 피하기 위해 전체 망막 체외이식편 준비 과정에서 기계적 손상을 최대한 최소화해야 합니다. 의도하지 않은 세포 사멸을 피하기 위해 체외이식편 준비에 소요되는 시간도 최소화해야 합니다.
4) 망막 체외이식편 배양은 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 외식편을 사용하여 수행하였다. 부착된 RPE 및 맥락막이 없는 망막을 사용하는 망막 세포의 시험관 내 배양과 비교할 때, 당사의 체외이식편 배양은 더 나은 세포 생존을 가능하게 하고 따라서 광수용체 세포의 생존을 연장합니다. 배양 과정에서 망막은 위쪽을 향하고 맥락막은 아래쪽을 향합니다. 마우스 망막 외식편과 비교할 때 원숭이 망막 외식편은 크기가 더 커서 배양 영양에 대한 요구가 더 큽니다. 따라서, 이전에 마우스 망막 체외이식편 배양에 사용되었던 배양액 교체 빈도를 2일에 한 번으로 채택하는 대신 원숭이 망막 체외이식편 배양을 위해 매일 배양액 교체를 수행하였다.
종합하면, 우리는 원숭이의 망막 외식편 배양과 RD 병인에서 관찰되는 것과 유사한 cGMP-PKG 신호 전달 경로를 유도하기 위해 zaprinast로 처리하여 시험관 내 NHP 모델을 확립했습니다. 자프리나스트는 PDE6 억제제이고, PDE6는 PKG17,18을 활성화시키는 cGMP의 세포내 농도의 균형을 유지한다. cGMP-PKG 경로는 산화적 인산화와 미토콘드리아 경로를 부정적으로 조절하여 망막 변성에 영향을 미칠 수 있다19. 이 시험관 내 NHP 망막 모델에서 cGMP-PKG 신호 전달 경로의 유도는 RD의 발병기전에 대한 향후 연구와 RD 치료를 위한 신약의 개발 및 독성 약리학 테스트에 유리한 모델로 확립됩니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 사용에는 몇 가지 제한 사항이 있으며, 특히 상대적으로 짧은 배양 기간과 영장류에 대한 상대적으로 높은 비용이 있습니다. 향후 연구에서 이 시험관 내 모델은 MEA 및 μERG를 사용하여 망막의 개입 후 기능 평가에 사용될 것입니다. PKG 표적의 정보 및 세포 위치는 다운스트림 이펙터(예: calpain, PARP 및 HDAC)의 활성 측정 및 관련 신경퇴행성 메커니즘에 대한 조사와 결합됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81960180), Zinke 유산 재단, Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구에 사용된 원숭이 안구를 공유해 주신 Longbao Lv 교수(중국 쿤밍 중국과학원 동물학 연구소)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
