Les allogreffes orthotopiques syngéniques de souris d’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) récapitulent la biologie, les phénotypes et les réponses thérapeutiques des sous-types de maladies. En raison de leur progression tumorale rapide et reproductible, ils sont largement utilisés dans les études précliniques. Ici, nous montrons des pratiques courantes pour générer ces modèles, en injectant des cultures PDAC murines syngéniques dans le pancréas.
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Article de méthode
Allogreffes orthotopiques de souris syngéniques pour modéliser le cancer du pancréas
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une maladie très complexe caractérisée par un microenvironnement tumoral hétérogène composé d’un stroma, de cellules immunitaires, de vaisseaux, de nerfs et de composants de la matrice extracellulaire. Au fil des ans, différents modèles murins de PDAC ont été développés pour relever les défis posés par sa progression, son potentiel métastatique et son hétérogénéité phénotypique. Les allogreffes orthotopiques de souris immunocompétentes de PDAC se sont révélées prometteuses en raison de leur progression tumorale rapide et reproductible par rapport aux modèles murins génétiquement modifiés. De plus, combinés à leur capacité à imiter les caractéristiques biologiques observées dans le PDAC autochtone, les modèles murins allogreffés orthotopiques basés sur des lignées cellulaires permettent des expériences in vivo à grande échelle. Ainsi, ces modèles sont largement utilisés dans les études précliniques pour les analyses rapides génotype-phénotype et pharmaco-réponse. L’objectif de ce protocole est de fournir une approche reproductible et robuste pour injecter avec succès des cultures primaires de cellules PDAC de souris dans le pancréas de souris receveuses syngéniques. En plus des détails techniques, des informations importantes sont données qui doivent être prises en compte avant d’effectuer ces expériences.
Introduction
Récemment, l’ACPE est devenue la troisième cause de décès liés au cancer dans le monde occidental1. Il provoque le taux de mortalité le plus élevé parmi tous les cancers et un taux de survie globale à 10 ans de ~ 1%, qui n’a pas changé depuis des décennies2. En raison de l’absence de progrès dans le traitement de la PDAC, cette maladie devrait devenir la deuxième cause de décès liés au cancer d’ici la prochaine décennie3.
Les tumeurs PDAC sont des entités complexes caractérisées par un microenvironnement tumoral diversifié (TME) composé d’un assemblage hétérogène de composants stroma, vasculaires, immunitaires et de matrice extracellulaire4. Les différences dans la composition du TME influencent le pronostic de la maladie et la réponse au traitement 4,5,6. En effet, de nombreuses études ont montré que le sous-type mésenchymateux basal de PDAC est associé à un TME hautement immunosuppresseur et montre une diminution de la survie et une absence de réponse aux thérapies 7,8,9,10,11,12. Par conséquent, une meilleure compréhension des différences dans la composition du TME et de la façon dont ces caractéristiques influencent la biologie tumorale reste un facteur important pour le développement de thérapies moléculairement précises. Pour mieux comprendre la biologie derrière ce phénotype complexe et identifier des stratégies thérapeutiques capables de surmonter la barrière que constitue le TME de PDAC, des modèles in vivo sont indispensables.
Un aspect clé de tout système de modèle préclinique de cancer est qu’il devrait imiter les phénotypes humains, récapitulant à la fois l’hétérogénéité génétique et le milieu incorporant la multitude de populations stromales et immunitaires qui composent le TME. Par conséquent, lors du choix de modèles murins pour la recherche préclinique, plusieurs aspects doivent être pris en considération. Pour étudier l’interaction tumorale-immunitaire, des lignées cellulaires cancéreuses histocompatibles peuvent être injectées à des souris immunocompétentes syngéniques. Dans la plupart des cas, ceux-ci sont injectés par voie sous-cutanée dans le flanc de la souris, ce qui permet une surveillance facile de la tumeur par palpation ou inspection visuelle. Cependant, les modèles résultants n’imitent pas la croissance des cellules tumorales dans leur organe d’origine. Par conséquent, les transplantations orthotopiques sont devenues l’étalon-or pour les modèles d’allogreffe.
Les allogreffes orthotopiques de souris présentent plusieurs avantages: elles sont rentables, peuvent être générées avec une procédure relativement simple et donnent lieu à des modèles avec une composition moléculaire connue, ainsi qu’une progression tumorale et un phénotype reproductibles et prévisibles. En effet, alors que les modèles de xénogreffes dérivés de patients représentent avec précision le comportement des cellules PDAC humaines, la nécessité de l’implantation chez des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffe limite l’analyse des interactions tumeur-immunité et tumeur-stroma, permettant aux chercheurs de ne capturer qu’une image partielle de la complexité de ces tumeurs. Les allogreffes orthotopiques syngéniques de PDAC présentent un avantage à cet égard également par rapport aux modèles murins génétiquement modifiés (GEMM). Les GEMM récapitulent avec précision la tumorigenèse PDAC humaine et l’hétérogénéité observée chez les patients PDAC. Cependant, en raison de ces caractéristiques, les tumeurs GEMM peuvent présenter une variance élevée dans leur constitution génétique, leur progression tumorale, leur agressivité, leur différenciation histologique et leur composition en ETM. Bien que cela puisse être un avantage dans certaines études, cela limite les études génotype à phénotype et l’étude ciblée des phénotypesPDAC 13. Par conséquent, les allogreffes orthotopiques de souris constituent un bon compromis et un bon modèle pour effectuer des études tumeur-hôte et de traitement in vivo. Cet article décrit un protocole pour les expériences de transplantation orthotopique de cellules PDAC murines dans le pancréas de souris.
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Protocole
Les expériences sur les animaux ont été approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) des autorités locales de l’Université technique de Munich et de la Regierung von Oberbayern.
1. Informations à prendre en considération avant la procédure
- S’assurer de l’approbation du protocole animal et du personnel par les autorités locales avant de commencer toute expérimentation animale.
- Sélectionnez les souris destinataires.
- Sélectionner des souris d’âges similaires pour l’implantation (souris receveuses C57Bl/6J avec une tranche d’âge comprise entre 2 mois et 4 mois).
- S’assurer que le sexe et le bagage génétique des animaux receveurs correspondent au sexe et au bagage génétique des animaux d’où provient la lignée cellulaire utilisée pour l’implantation (allogreffes syngéniques).
- Préparez les souris pour l’implantation.
REMARQUE: Manipulez les souris conformément aux normes d’hygiène de l’animalerie locale.- Le jour de l’implantation, ne nourrissez pas les souris 4 h avant la procédure pour éviter les complications dues à l’administration d’anesthésiques.
- Pesez les souris avant l’implantation pour calculer la quantité d’anesthésiques nécessaires.
- Transférez les souris dans la salle d’opération.
- Sélectionnez les lignées cellulaires PDAC.
- S’assurer que le bagage génétique et le sexe des souris à partir desquelles les lignées cellulaires sont dérivées correspondent au fond et au sexe des souris receveuses (p. ex., les lignées cellulaires PDAC 1-3 précédemment générées à partir de GEMM PDAC sur un fond C57Bl/6J en laboratoire avec les génotypes suivants, comme décrit précédemment14 : PDAC 1 et 2 : ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3 : Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Sélectionnez les lignées cellulaires qui n’expriment pas de protéines potentiellement immunogènes.
- Culture des lignées cellulaires PDAC.
REMARQUE: Effectuez le travail de culture cellulaire sous une hotte à flux laminaire. Désinfectez les gants, l’espace de travail et le matériel avant de travailler.- Décongeler les cellules 1 semaine avant l’implantation en remettant la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de culture cellulaire. Faites tourner les cellules, aspirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et faites tourner les cellules à nouveau. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,1 % de pénicilline-streptomycine (PS). Transférer la suspension cellulaire dans une fiole de 25 cm².
- Passage des lignées cellulaires au moins une fois avant l’implantation.
- Retirer le milieu cellulaire, laver 1x avec du PBS et ajouter 0,5 mL de trypsine pour détacher les cellules du flacon. Incuber les cellules à 37 °C jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon (selon la lignée cellulaire, cela prend généralement 5 à 10 minutes). Lorsque les cellules sont détachées, remettre les cellules en suspension dans 10 ml de DMEM avec 10% FBS et 0,1% PS et transférer la suspension cellulaire dans une fiole de 75 cm².
REMARQUE: Comme FBS inactive la trypsine, il entraverait la trypsinisation.
- Retirer le milieu cellulaire, laver 1x avec du PBS et ajouter 0,5 mL de trypsine pour détacher les cellules du flacon. Incuber les cellules à 37 °C jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon (selon la lignée cellulaire, cela prend généralement 5 à 10 minutes). Lorsque les cellules sont détachées, remettre les cellules en suspension dans 10 ml de DMEM avec 10% FBS et 0,1% PS et transférer la suspension cellulaire dans une fiole de 75 cm².
- Assurer une confluence de ~70%-80% le jour de l’implantation.
- Matériel nécessaire à l’implantation
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux.
- Gardez les anesthésiques prêts en fonction de la licence d’expérimentation animale.
- Utilisez le méloxicam pour l’analgésie au moins 5 minutes à l’avance comme analgétique de longue durée avec des propriétés anti-inflammatoires.
- Pour la chirurgie, utilisez une combinaison de midazolam, de médétomidine et de fentanyl (MMF) pour l’analgosédation.
- Utilisez une combinaison d’atipamezole, de flumazénil et de naloxone (AFN) pour antagoniser l’analgosédation MMF après l’implantation.
- Préparez un champ stérile, un tapis chauffant, un rasoir, des gants, une crème pour les yeux, du chlorure de sodium à 0,9 %, un gommage chirurgical à base d’iode ou de chlorhexidine, de l’éthanol à 80 %, une suture soluble, des clips de plaie, une seringue à volume d’injection de 50 μL et du ruban adhésif.
2. Préparation des lignées cellulaires avant l’implantation
REMARQUE: Préparez les cellules tumorales uniquement lorsque les souris sont prêtes pour l’implantation. Assurer un court laps de temps entre la récolte ou la collecte des cellules et l’implantation.
- Réchauffer tous les liquides à 37 °C avant utilisation.
- Préparer les cellules (à partir de 1x T75 (une fiole de culture de 75 cm 2) comme décrit à l’étape 1.5.2.1 jusqu’à ce qu’elles se détachent de la fiole. Remettez les cellules en suspension dans 10 mL de DMEM avec 10% FBS et 0,1% PS et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL.
- Faire tourner les cellules à 200 × g pendant 5 min dans une centrifugeuse. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume adéquat de DMEM sans additifs en fonction de la concentration finale requise des cellules injectables. Utilisez 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer et calculer le nombre de cellules disponibles.
- Diluer les cellules jusqu’au nombre final requis de cellules pour injection (p. ex. 2 500 cellules dans 20 μL) dans du DMEM sans additifs. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire diluée dans un tube de 1,5 mL. Placez le tube sur un rotateur jusqu’à l’implantation pour empêcher les cellules de s’agréger.
3. Implantation orthotopique des cellules PDAC
REMARQUE: En cas d’expérience chirurgicale insuffisante, entraînez-vous d’abord avec des cadavres et obtenez une formation adéquate, par exemple, dans le cadre d’un protocole de dressage d’animaux. Le personnel effectuant la chirurgie et les expériences sur les animaux doit remplir les critères des autorités respectives et les directives institutionnelles.
- Utilisez le méloxicam comme analgésique périopératoire et appliquez 5 mg / kg de poids corporel par voie sous-cutanée.
- Injecter par voie intrapéritonéale MMF en fonction du poids corporel de chaque souris (midazolam [5,0 mg/kg], médétomidine [0,5 mg/kg] et fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Remettez la souris dans la cage pendant 10-15 min.
- Appliquez la crème pour les yeux lorsque la souris dort.
- Vérifiez une analgosédation suffisante après 10 min en testant le réflexe de retrait de la pédale (pincez les coussinets des deux pattes postérieures). En cas de réponse, appliquer 1/3 de la dose initiale d’analgosédation. Après 10 min, répétez la procédure et ne procédez qu’en l’absence d’un réflexe de retrait de la pédale.
- Rasez le flanc abdominal latéral gauche de la souris. Placez la souris couchée sur le côté droit sur un tapis chauffant stérile et collez ses pattes à la surface. Désinfectez l’abdomen à l’aide d’un gommage chirurgical à base d’iode ou de chlorhexidine suivi d’un mouvement circulaire à 80% d’éthanol et répétez la procédure trois fois. Pour maintenir la stérilité du champ chirurgical, utilisez un champ chirurgical.
- Portez de nouveaux gants et désinfectez-les. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau et le tissu adipeux sous-cutané longitudinalement sur le flanc gauche où la rate est projetée. Effectuez une coupe d’environ 1 cm de longueur.
- À l’aide de ciseaux et de forceps, séparez la peau du péritoine pour obtenir un accès plus facile au péritoine.
- Changez la paire de ciseaux. Ouvrez le péritoine à l’emplacement de la rate avec une coupe longitudinale de 1 cm.
- Mobiliser la rate et le pancréas attaché à l’aide d’une pince émoussée à pointe fine. Assurez-vous que les organes ne sont pas attachés à d’autres tissus et vérifiez s’il y a des vaisseaux sanguins pour éviter de blesser les vaisseaux ou les tissus environnants lors de la manipulation du pancréas.
REMARQUE: Ne saisissez pas la rate directement pour éviter les saignements. - Retirez soigneusement le pancréas de l’incision pour permettre un accès plus facile à la queue de l’organe et observez la rate après le pancréas. Utilisez la main non dominante pour saisir le pancréas avec une pince et coupez soigneusement les ligaments qui empêchent le pancréas d’extracorporeller. Assurez-vous que l’organe n’est pas plié pendant l’injection et que la capsule de l’organe est maintenue sous tension au site de pénétration de l’aiguille pour éviter les déversements.
- Utilisez la main dominante pour effectuer l’injection. Pénétrez soigneusement dans la capsule de l’organe avec l’aiguille de la seringue en suivant l’axe longitudinal de l’organe. Visez un morceau de tissu pancréatique entre les vaisseaux sanguins visibles pour minimiser le risque de perforation ou d’injection dans un vaisseau. Injecter lentement un nombre adéquat de cellules selon le plan expérimental (ici, 2 500 cellules dans 20 μL de DMEM) avec une canule de 27 G et une seringue de 50 μL dans la région de la queue du pancréas.
REMARQUE: Une bulle transparente se forme lors d’une injection réussie dans le tissu. - Gardez le pancréas et la seringue insérée immobiles pendant environ 1 min pour éviter le déversement des cellules tumorales. Retirez soigneusement l’aiguille du site d’injection.
REMARQUE: Changez les aiguilles entre les souris et utilisez une nouvelle seringue stérile pour l’injection d’une nouvelle lignée cellulaire. - Réorganisez soigneusement les organes à l’intérieur de l’abdomen. Veillez à ne pas blesser le tissu pour éviter le déversement des cellules. Verser 1 mL de chlorure de sodium à 0,9 % sur les organes pour éviter l’adhérence des organes.
- Suturer soigneusement le péritoine en utilisant la technique simple de suture interrompue et fermer la peau à l’aide de deux à trois clips enroulés en acier inoxydable de 9 mm.
REMARQUE: Retirez les clips de la plaie 7 jours après l’implantation si l’incision chirurgicale est guérie. - Si nécessaire, prévenir la déshydratation des animaux due à la procédure et à l’anesthésie en injectant 0,5 mL de chlorure de sodium par voie sous-cutanée.
- Après implantation, antagoniser l’analgosédation par MMF avec une injection sous-cutanée d’AFN (atipamezol [2,5 mg/kg], flumazénil [0,5 mg/kg], naloxon [1,2 mg/kg]), en fonction du poids corporel de la souris.
- Placez la souris dans une chambre chauffée à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit éveillée et complètement active. Ensuite, replacez la souris dans sa cage d’origine. Surveillez l’état de santé de la souris en vérifiant la fourrure, la couleur de la peau et l’activité et répétez cette opération 3-4 heures après la chirurgie.
4. Suivi pour les souris
- Donnez aux souris accès à de l’eau et à de la nourriture lorsqu’elles sont de retour dans l’animalerie.
- Continuer l’application sous-cutanée ou orale de méloxicam (5 mg / kg) toutes les 6-12 heures pendant 2-3 jours après la chirurgie.
- Surveiller régulièrement l’état de santé des souris selon le protocole animal et les directives institutionnelles.
- Selon le but de l’expérience, surveiller la croissance tumorale chaque semaine ou plus fréquemment par palpation, imagerie par ultrasons, bioluminescence (BLI) ou imagerie par résonance magnétique (IRM).
REMARQUE: En fonction de la méthode choisie, du taux de croissance et du nombre de cellules implantées, une tumeur peut être détectée dès 1 semaine après l’injection.
5. Récolte de greffes de tumeurs
- Récolter les tumeurs à la fin de l’expérience ou lorsque les souris doivent être euthanasiées selon les critères des comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux ou de la licence d’expérimentation animale.
- Euthanasier la souris en utilisant une méthode autorisée par la licence d’expérimentation animale.
REMARQUE: Effectuez des étapes avec une perte de temps minimale pour minimiser le temps d’ischémie. Par conséquent, la luxation cervicale est recommandée car il s’agit d’une méthode rapide et le moment de la mort peut être déterminé avec précision, contrairement aux saignements terminaux ou aux méthodes chimiques. - Placez la souris couchée sur le dos sur un tapis stérile et collez ses pattes à la surface. Utilisez de l’éthanol à 80% pour désinfecter l’abdomen.
- Portez de nouveaux gants et désinfectez-les. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau longitudinalement sur l’abdomen central.
- À l’aide de ciseaux et de forceps, séparez la peau du péritoine pour obtenir un accès plus facile au péritoine.
- Changez la paire de ciseaux. Ouvrez le péritoine au niveau de l’abdomen central avec une coupe longitudinale de 5 cm.
- Mobiliser la rate et le pancréas attaché à l’aide d’une pince émoussée à pointe fine. Détachez soigneusement la tumeur du tissu environnant à l’aide de forceps et de ciseaux chirurgicaux.
- Stocker le tissu tumoral dans un milieu adapté aux expériences en aval. Traiter les tissus immédiatement ou, si nécessaire, conserver l’échantillon à 4 °C pendant 6 heures au maximum jusqu’à la poursuite du traitement.
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Résultats
Dans le cadre d’une étude de pharmaco-réponse à grande échelle, nous avons implanté avec succès plus de 170 souris (souris receveuses C75Bl6/J, sexe de souris mâles et femelles apparié aux lignées cellulaires PDAC injectées) en utilisant le protocole décrit ci-dessus, illustré dans ses principales étapes à la figure 112. Dans ce protocole, nous avons implanté orthotopiquement trois lignées cellulaires PDAC KrasG12D (PDAC 1 et 2 : Ptf1aCre/...
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Discussion
Les allogreffes orthotopiques syngéniques de souris représentent un modèle robuste pour les études précliniques en raison de leur rentabilité, de leur reproductibilité et de leurs procédures expérimentales relativement simples13,15. Ces modèles permettent non seulement l’étude des interactions tumeur-hôte, mais garantissent également la préservation de l’hétérogénéité génétique des tumeurs dont ils proviennent lorsque des cultures primaires de cellules de souris ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier l’animalerie TUM et l’installation centrale d’imagerie du département de médecine nucléaire, Klinikum rechts der Isar, pour leur excellent soutien technique. Cette étude a été soutenue par le German Cancer Consortium (DKTK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 et S01) à D.S., la Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 et 2017.091.2) à D.S., et le Conseil européen de la recherche (ERC CoG No. 648521, à D.S.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Canule de 27 g | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Clips enroulés en acier inoxydable, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium ; | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Crème pour les yeux (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µ ; g/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0,1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Seringue d’un microlitre | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0,4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Pénicilline-Streptomycine | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | ||
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Références
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