Summary
אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של אדנוקרצינומה צינורית הלבלב (PDAC) משחזרים את הביולוגיה, הפנוטיפים והתגובות הטיפוליות של תת-סוגי מחלות. בשל התקדמות הגידול המהירה והניתנת לשחזור, הם נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים. כאן, אנו מראים שיטות עבודה נפוצות ליצירת מודלים אלה, הזרקת תרביות PDAC מורין סינגני לתוך הלבלב.
Abstract
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא מחלה מורכבת מאוד המאופיינת במיקרו-סביבה הטרוגנית של הגידול המורכבת ממגוון רחב של סטרומה, תאי מערכת החיסון, כלי הדם, העצבים ומרכיבי מטריצה חוץ-תאיים. במהלך השנים פותחו מודלים עכבריים שונים של PDAC כדי להתמודד עם האתגרים שמציבים התקדמותו, הפוטנציאל הגרורתי וההטרוגניות הפנוטיפית שלו. השתלות אורתוטופיות של PDAC בעכברים בעלי יכולת חיסונית הראו הבטחה טובה הודות להתקדמות הגידול המהירה והניתנת לשחזור שלהם בהשוואה למודלים של עכברים מהונדסים גנטית. יתר על כן, בשילוב עם יכולתם לחקות את התכונות הביולוגיות שנצפו ב- PDAC אוטוכתוני, מודלים של עכברי אלוגרפט אורתוטופיים מבוססי קו תאים מאפשרים ניסויים בקנה מידה גדול in vivo . לפיכך, מודלים אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים לניתוח גנוטיפ-פנוטיפ מהיר וניתוח תגובה לתרופות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה ניתנת לשחזור וחזקה להזרקה מוצלחת של תרביות תאי PDAC ראשוניים של עכברים ללבלב של עכברים מושתלים סינגניים. בנוסף לפרטים הטכניים, ניתן מידע חשוב שיש לקחת בחשבון לפני ביצוע ניסויים אלה.
Introduction
לאחרונה, PDAC הפך לגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן בעולם המערבי1. זה גורם לשיעור התמותה הגבוה ביותר מבין כל סוגי הסרטן ולשיעור הישרדות כולל של 10 שנים של ~1%, שלא השתנה במשך עשרות שנים2. בשל חוסר ההתקדמות בטיפול ב- PDAC, מחלה זו צפויה להפוך לגורם השני המוביל למוות הקשור לסרטן בעשור הבא3.
גידולי PDAC הם ישויות מורכבות המאופיינות במיקרו-סביבה גידולית מגוונת (TME) המורכבת מהרכבה הטרוגנית של רכיבי מטריצה סטרומה, כלי דם, חיסוניים וחוץ-תאיים4. הבדלים בהרכב ה-TME משפיעים על פרוגנוזה של המחלה ועל התגובה לטיפול 4,5,6. ואכן, מחקרים רבים הראו כי תת-הסוג הבסיסי והמזנכימלי של PDAC קשור ל-TME מדכא מערכת החיסון ומראה ירידה בהישרדות וחוסר תגובה לטיפולים 7,8,9,10,11,12. לכן, הבנה עמוקה יותר של ההבדלים בהרכב TME וכיצד תכונות אלה משפיעות על הביולוגיה של הגידול נותרה גורם חשוב לפיתוח טיפולים מדויקים מולקולרית. כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה שמאחורי פנוטיפ מורכב זה ולזהות אסטרטגיות טיפוליות המסוגלות להתגבר על המחסום שה- TME של PDAC מהווה, מודלים in vivo הם הכרחיים.
היבט מרכזי עבור כל מערכת מודל פרה-קליני של סרטן הוא שהיא צריכה לחקות פנוטיפים אנושיים, לשחזר הן את ההטרוגניות הגנטית והן את הסביבה המשלבת את ריבוי אוכלוסיות הסטרומה והחיסון המרכיבות את TME. לכן, בעת בחירת מודלים עכבר למחקר פרה-קליני, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. כדי לחקור את האינטראקציה בין הגידול למערכת החיסון, ניתן להזריק שורות תאים סרטניים תואמות היסטו לעכברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית. ברוב המקרים, אלה מוזרקים תת עורית לתוך האגף של העכבר, המאפשר ניטור קל של הגידול על ידי מישוש או בדיקה חזותית. עם זאת, המודלים המתקבלים אינם מחקים את הצמיחה של תאים סרטניים באיבר המוצא שלהם. לכן, השתלות אורתוטופיות הפכו לתקן הזהב עבור מודלים allograft.
לאלוגרפים אורתוטופיים של עכברים יש מספר יתרונות: הם חסכוניים, ניתן ליצור אותם בהליך פשוט יחסית, והתוצאה היא מודלים עם הרכב מולקולרי ידוע, כמו גם התקדמות ופנוטיפ גידול הניתנים לשחזור וצפויים. ואכן, בעוד שמודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופלים מייצגים את ההתנהגות של תאי PDAC אנושיים בצורה מדויקת, הצורך בהשתלה בעכברים מדוכאי חיסון כדי למנוע דחיית שתלים מגביל את ניתוח האינטראקציות בין גידול-חיסון לגידול-סטרומה, ומאפשר לחוקרים ללכוד תמונה חלקית בלבד של מורכבות גידולים אלה. לאלוגרפים אורתוטופיים סינגניים של PDAC יש יתרון בהקשר זה גם בהשוואה למודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM). GEMMs משחזרים במדויק גידולי PDAC אנושיים ואת ההטרוגניות שנצפתה בחולי PDAC. עם זאת, בגלל תכונות אלה, גידולי GEMM יכולים להראות שונות גבוהה בהרכב הגנטי שלהם, התקדמות הגידול, אגרסיביות, התמיינות היסטולוגית והרכב TME. בעוד שזה יכול להיות יתרון במחקרים מסוימים, זה מגביל מחקרי גנוטיפ לפנוטיפ ואת החקירה הממוקדת של פנוטיפים PDAC13. לכן, אלושתלים אורתוטופיים של עכברים מהווים פשרה טובה ומודל לביצוע מחקרי גידול-מארח וטיפול in vivo. מאמר זה מתאר פרוטוקול לניסויי השתלה אורתוטופיים של תאי PDAC מורינים בלבלב העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUCs) של הרשויות המקומיות של האוניברסיטה הטכנית של מינכן ורג'ירונג פון אוברבאיירן.
1. מידע שיש לקחת בחשבון לפני ההליך
- להבטיח את אישור פרוטוקול בעלי החיים וכוח האדם על ידי הרשויות המקומיות לפני תחילת כל ניסוי בבעלי חיים.
- בחר עכברים נמענים.
- בחר עכברים בגילאים דומים להשתלה (עכברים מושתלי C57Bl/6J בטווח הגילאים שבין חודשיים לארבעה חודשים).
- ודא שהמין והרקע הגנטי של בעלי החיים המקבלים תואמים את המין והרקע הגנטי של בעלי החיים שמהם הגיע קו התאים המשמש להשתרשה (allografts syngeneic).
- הכינו את העכברים להשתלה.
הערה: יש לטפל בעכברים בהתאם לסטנדרטים ההיגייניים של מתקן בעלי החיים המקומי.- ביום ההשתלה, אין להאכיל את העכברים 4 שעות לפני ההליך כדי למנוע סיבוכים עקב ניהול הרדמה.
- שקלו את העכברים לפני ההשתלה כדי לחשב את כמות חומרי ההרדמה הדרושים.
- מעבירים את העכברים לחדר ניתוח.
- בחר את שורות תאי PDAC.
- ודא שהרקע הגנטי והמין של העכברים שמהם נגזרים קווי התאים תואמים לרקע ולמין של העכברים המקבלים (לדוגמה, קווי תאי PDAC PDAC 1-3 שנוצרו בעבר מ- PDAC GEMMs על רקע C57Bl/6J במעבדה עם הגנוטיפים הבאים, כפי שתואר קודם לכן14: PDAC 1 ו- 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1a cre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- בחר את קווי התאים שאינם מבטאים חלבונים שעשויים להיות אימונוגניים.
- תרבית את קווי תאי PDAC.
הערה: בצע את עבודת תרבית התאים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. יש לחטא את הכפפות, חלל העבודה והחומרים לפני העבודה.- הפשיר את התאים 1 שבוע לפני ההשתלה על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים. סובבו את התאים, שאפו את הסופר-נטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), וסובבו שוב את התאים. הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 5 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו 0.1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS). מעבירים את מתלה התא לצלוחית בגודל 25 סמ"ר.
- עברו את שורות התאים לפחות פעם אחת לפני ההשתלה.
- הסר את התא בינוני, לשטוף 1x עם PBS, ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין כדי לנתק את התאים מן הצלוחית. לדגור על התאים ב 37 ° C עד שהם להתנתק מן הבקבוק (בהתאם לקו התא, זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות). כאשר התאים מנותקים, להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו 0.1% PS ולהעביר את תרחיף התא לצלוחית 75 סמ"ר.
הערה: כאשר FBS משבית טריפסין, זה יעכב טריפסיניזציה.
- הסר את התא בינוני, לשטוף 1x עם PBS, ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין כדי לנתק את התאים מן הצלוחית. לדגור על התאים ב 37 ° C עד שהם להתנתק מן הבקבוק (בהתאם לקו התא, זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות). כאשר התאים מנותקים, להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו 0.1% PS ולהעביר את תרחיף התא לצלוחית 75 סמ"ר.
- להבטיח מפגש של ~70%-80% ביום ההשתלה.
- חומר הדרוש להשתלה
- Autoclave כל כלי הניתוח.
- יש להכין את חומרי ההרדמה בהתאם לרישיון הניסוי בבעלי חיים.
- השתמש meloxicam עבור שיכוך כאבים לפחות 5 דקות מראש כמו analgetic לאורך זמן עם תכונות אנטי דלקתיות.
- לניתוח, השתמש בשילוב של midazolam, medetomidine, ופנטניל (MMF) עבור analgosedation.
- השתמש בשילוב של atipamezole, flumazenil, ו naloxone (AFN) עבור אנטגוניזם MMF analgosedation לאחר ההשתלה.
- הכינו שריטה סטרילית, שטיחון חימום, מכונת גילוח, כפפות, קרם עיניים, 0.9% נתרן כלורי, פילינג כירורגי על בסיס יוד או כלורהקסידין, 80% אתנול, תפר מסיס, אטבי פצעים, מזרק בנפח הזרקה של 50 מיקרוליטר וסרט הדבקה.
2. הכנת שורות התאים לפני ההשתלה
הערה: הכינו את תאי הגידול רק כאשר העכברים מוכנים להשתלה. הקפידו על מסגרת זמן קצרה בין הקציר או איסוף התאים לבין ההשתלה.
- יש לחמם את כל הנוזלים ל-37°C לפני השימוש.
- הכן את התאים (החל מ 1x T75 (75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית) כמתואר בשלב 1.5.2.1 עד שהם מתנתקים מן הצלוחית. להשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו 0.1% PS ולהעביר את השעיית התא צינור 15 מ"ל.
- סובבו את התאים במהירות של 200 × גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגה. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא בנפח מספיק של DMEM ללא תוספים המבוססים על הריכוז הסופי הנדרש של התאים להזרקה. השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר ולחשב את מספר התאים הזמינים.
- לדלל את התאים למספר הסופי הנדרש של תאים להזרקה (למשל, 2,500 תאים ב 20 μL) ב DMEM ללא תוספים. העבר 1 מ"ל של תרחיף התא המדולל לצינור 1.5 מ"ל. הניחו את הצינור על מסובב עד להשתלה כדי למנוע הצטברות של תאים.
3. השתלה אורתוטופית של תאי PDAC
הערה: במקרה של ניסיון כירורגי לא מספיק, תרגלו תחילה עם גופות וקבלו הכשרה מתאימה, למשל, במסגרת פרוטוקול אילוף בעלי חיים. הצוות המבצע את הניתוח ואת הניסויים בבעלי חיים צריך לעמוד בקריטריונים של הרשויות בהתאמה ואת ההנחיות המוסדיות.
- השתמש meloxicam כמו משכך כאבים perioperative ולהחיל 5 מ"ג / ק"ג משקל הגוף תת עורית.
- הזרקה תוך-צפקית של MMF בהתאם למשקל הגוף של כל עכבר (מידזולאם [5.0 מ"ג/ק"ג], מדטומידין [0.5 מ"ג/ק"ג] ופנטניל [0.05 מ"ג/ק"ג]).
- החזירו את העכבר לכלוב למשך 10-15 דקות.
- החל קרם עיניים כאשר העכבר ישן.
- בדוק מספיק analgosedation לאחר 10 דקות על ידי בדיקת רפלקס נסיגה הדוושה (צביטה על כריות כף הרגל של שתי הרגליים האחוריות). במקרה של תגובה, להחיל 1/3 של המינון המקורי של analgosedation. לאחר 10 דקות, חזור על ההליך והמשך רק בהיעדר רפלקס נסיגה מדוושה.
- לגלח את האגף השמאלי הלטרלי של הבטן של העכבר. הניחו את העכבר שוכב בצד ימין על משטח חימום סטרילי והדביקו את רגליו אל פני השטח. יש לחטא את הבטן באמצעות פילינג כירורגי על בסיס יוד או כלורהקסידין ואחריו 80% אתנול בתנועה מעגלית ולחזור על ההליך שלוש פעמים. כדי לשמור על סטריליות של שדה הניתוח, להשתמש drape כירורגי.
- ללבוש כפפות חדשות ולחטא אותם. השתמש מספריים כירורגיים לחתוך את העור ואת רקמת השומן תת עורית לאורך בצד שמאל שבו הטחול מוקרן. בצעו חתך באורך של כ-1 ס"מ.
- באמצעות מספריים ומלקחיים, להפריד את העור מן הצפק כדי לקבל גישה קלה יותר הצפק.
- שנה את זוג המספריים. פתח את הצפק במיקום הטחול עם חתך אורכי של 1 ס"מ.
- גייסו את הטחול ואת הלבלב המחובר באמצעות מלקחיים קהים ועדינים. ודא שהאיברים אינם מחוברים לרקמות אחרות ובדוק אם הם מספקים כלי דם כדי למנוע פגיעה בכלי הדם או ברקמה שמסביב בעת הטיפול בלבלב.
הערה: אין לתפוס את הטחול ישירות כדי למנוע דימום. - משכו בזהירות את הלבלב מהחתך כדי לאפשר גישה קלה יותר לזנב האיבר והתבוננו בטחול בעקבות הלבלב. השתמש ביד הלא דומיננטית כדי לתפוס את הלבלב עם מלקחיים בזהירות לחתוך את הרצועות המונעות את הלבלב מ extracorporalization. יש לוודא כי האיבר אינו מקופל במהלך ההזרקה וכי קפסולת האיבר מוחזקת תחת מתח במקום חדירת המחט כדי למנוע שפיכה.
- השתמש ביד הדומיננטית כדי לבצע את ההזרקה. בזהירות לחדור את הקפסולה של האיבר עם המחט של המזרק בעקבות ציר האורך של האיבר. יש לכוון לחתיכת רקמת לבלב בין כלי הדם הנראים לעין כדי למזער את הסיכון לניקוב או הזרקה לכלי דם. הזריקו באיטיות מספר מספיק של תאים בהתאם לתוכנית הניסוי (כאן, 2,500 תאים ב-20 מיקרוליטר DMEM) עם צינורית 27 גרם ומזרק 50 מיקרוליטר לאזור הזנב של הלבלב.
הערה: בועה שקופה נוצרת עם הזרקה מוצלחת לרקמה. - שמור את הלבלב ואת מזרק מוכנס עדיין במשך כ 1 דקות כדי למנוע שפיכה של תאי הגידול. הסר את המחט בזהירות מאתר ההזרקה.
הערה: החליפו מחטים בין עכברים והשתמשו במזרק סטרילי חדש להזרקת קו תאים חדש. - סדרו מחדש את האיברים בתוך הבטן בזהירות. היזהר לא לפגוע ברקמה כדי למנוע שפיכה של התאים. שפכו 1 מ"ל של 0.9% נתרן כלורי על האיברים כדי למנוע הידבקות איברים.
- תפרו בזהירות את הצפק בטכניקת התפר הקטועה הפשוטה וסגרו את העור באמצעות שניים עד שלושה אטבי פצע נירוסטה 9 מ"מ.
הערה: הסר את קליפסי הפצע 7 ימים לאחר ההשתלה אם החתך הניתוחי החלים. - במידת הצורך, למנוע התייבשות של בעלי החיים עקב ההליך ואת ההרדמה על ידי הזרקת 0.5 מ"ל של נתרן כלורי תת עורית.
- לאחר ההשתלה, אנטגוניזם את האנלגוסדציה על ידי MMF עם הזרקה תת עורית של AFN (atipamezol [2.5 מ"ג / ק"ג], flumazenil [0.5 מ"ג / ק"ג], naloxon [1.2 מ"ג / ק"ג]), על פי משקל הגוף של העכבר.
- הניחו את העכבר בתא מחומם בטמפרטורה של 37°C עד שהוא ער ופעיל לחלוטין. לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלוב המקורי שלו. עקוב אחר מצב הבריאות של העכבר על ידי בדיקת הפרווה, צבע העור והפעילות וחזור על כך 3-4 שעות לאחר הניתוח.
4. טיפול לאחר העכברים
- תן לעכברים גישה למים ולמזון כאשר הם חוזרים למתקן בעלי החיים.
- המשך מריחה תת עורית או פומית של meloxicam (5 מ"ג / ק"ג) כל 6-12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח.
- יש לעקוב אחר מצבם הבריאותי של העכברים באופן קבוע בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים ולהנחיות המוסדיות.
- בהתאם למטרת הניסוי, עקוב אחר צמיחת הגידול מדי שבוע או בתדירות גבוהה יותר על ידי מישוש, הדמיית אולטרסאונד, ביולומינסנציה (BLI) או דימות תהודה מגנטית (MRI).
הערה: בהתבסס על שיטת הבחירה, קצב הצמיחה ומספר התאים המושתלים, ניתן לזהות גידול כבר שבוע לאחר ההזרקה.
5. קצירת שתלי גידול
- קצרו את הגידולים בסוף הניסוי או כאשר יש צורך להרדים את העכברים בהתאם לקריטריונים של ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים או רישיון לניסויים בבעלי חיים.
- יש להרדים את העכבר בשיטה המותרת ברישיון הניסוי בבעלי חיים.
הערה: בצע שלבים עם אובדן זמן מינימלי כדי למזער את זמן האיסכמיה. לכן, פריקת צוואר הרחם מומלצת מכיוון שמדובר בשיטה מהירה וניתן לקבוע את מועד המוות בדיוק, בניגוד לדימום סופני או שיטות כימיות. - הניחו את העכבר בשכיבה על מחצלת סטרילית והדביקו את רגליו אל פני השטח. השתמש 80% אתנול כדי לחטא את הבטן.
- ללבוש כפפות חדשות ולחטא אותם. השתמש מספריים כירורגיים לחתוך את העור לאורך על הבטן המרכזית.
- באמצעות מספריים ומלקחיים, להפריד את העור מן הצפק כדי לקבל גישה קלה יותר הצפק.
- שנה את זוג המספריים. פתח את הצפק בבטן המרכזית עם חתך אורכי של 5 ס"מ.
- גייסו את הטחול ואת הלבלב המחובר באמצעות מלקחיים קהים ועדינים. נתקו בזהירות את הגידול מהרקמה שמסביב באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיים.
- אחסנו את רקמת הגידול בתווך המתאים לניסויים במורד הזרם. לעבד את הרקמות באופן מיידי או, במידת הצורך, לשמור את הדגימה ב 4 °C למשך מקסימום של 6 שעות עד עיבוד נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהקשר של מחקר בקנה מידה גדול של תגובה לתרופות, השתלנו בהצלחה יותר מ-170 עכברים (עכברים מושתלי C75Bl6/J, מין עכברים זכר ונקבה שהותאמו לשורות תאי PDAC שהוזרקו) באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, שהודגם בשלבים העיקריים שלו באיור 112. בפרוטוקול זה, השתלנו אורתוטופית שלושה קווי תאי PDAC מונחי Kras G12D (PDAC 1 ו-2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1a cre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), אשר נוצרו בעבר במעבדה. ניתן למשש את הבטן של תאי PDAC מוקדם יותר כ-7 ימים לאחר הניתוח, בהתאם למספר התאים המוזרק ולמאפייני האגרסיביות והצמיחה של קו התאים המחוסן. MRI (איור 2A), אולטרסאונד ו-BLI של בטן העכבר יכולים לשמש למדידות כמותיות של נפח הגידול. בהתאם למאפיינים הפנימיים של תאי הגידול של קווי התא, הישרדותם של העכברים המושתלים יכולה להשתנות (איור 2B). זריקות תוך-לבלב מוצלחות מובילות לגידולים מלאים בלבלב העכבר (איור 2C,D). לעומת זאת, השתלות לא מוצלחות יכולות לגרום להיעדר גידולי לבלב בגלל א) הזרקה של תאים שאינם ברי קיימא, ב) דחייה של התאים המושתלים (למשל, אם התאים לא היו סינגניים לעכבר המקבל), או ג) מספר לא מספיק של תאים שהוזרקו. תוצאות שליליות חלופיות יכולות להוביל להיעדר גידול ראשוני בלבלב אך לנוכחות גידול בצפק, המתאים לאתר ההזרקה (למשל, באמצעות שפיכת תרחיף תאי הגידול מאתר הזרקת הלבלב).
איור 1: ייצוג סכמטי של השלבים העיקריים של הפרוטוקול . (A) תאי PDAC צריכים לעבור לפחות פעם אחת לפני ההשתלה. (B) תאים עוברים טריפסינזציה כדי לנתק אותם מהבקבוק, מועברים לצינור של 15 מ"ל ונספרים. (ג) דילול התאים המתאים מונח בצינור ומובא לחדר ההשתלה. (ד) העכבר המושתל מורדם, מגולח ומחוטא באזור שבו יתבצע הניתוח. (E) חתך של 1 ס"מ נעשה בבטן העכבר המתאים למיקום זנב הלבלב. (F) מספר התאים הרצוי מוזרק לזנב הלבלב. קיצור: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות לתוצאות מוצלחות של אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של עכברים . (A) MRI מייצג של עכבר שבועיים לאחר השתלה אורתוטופית של תאי PDAC ראשוניים בעכבר. מתאר מקווקו מציין את הגידול. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (B) עקומת הישרדות קפלן-מאייר של שלושה קווי תאי PDAC שונים של עכברים (PDAC 1-3) שהושתלו אורתוטופית בלבלב של עכברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית (רקע C57Bl/6J). (C) תמונה מייצגת של גידול שבודד בנקודת הקצה מקו תאי PDAC1 המוזרק באורתוטופית. הן גידול בלבלב כתוצאה מהזרקה תוך לבלב מוצלחת של תאי הגידול והן הטחול מוצגים בתצלום. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (D) Barplot המתאר את משקל הגידול הממוצע של גידולים מושתלים אורתוטופית מ- PDAC 1-3. נקודות מייצגות עכברים בודדים. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; MRI = הדמיית תהודה מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של עכברים מייצגים מודל חזק למחקרים פרה-קליניים בשל עלות-תועלתם, יכולת השחזור שלהם והליכי ניסוי פשוטים יחסית13,15. מודלים אלה לא רק מאפשרים לחקור אינטראקציות גידול-מארח, אלא גם מבטיחים את שימור ההטרוגניות הגנטית של הגידולים שמהם הם מגיעים כאשר תרביות תאי עכבר ראשוניות משמשות לניסוי.
פרוטוקול זה מציג הליך פשוט ומהיר להשתלה אורתוטופית של תרביות תאי PDAC בעכבר בלבלב. כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור, יש לזכור מספר שיקולים טכניים, כולל איכות הטכניקה הכירורגית. מכיוון שהפרקטיקות הכירורגיות משתנות, רצוי שאדם אחד יבצע את כל הזריקות האורתוטופיות באותו ניסוי.
הזרקת התאים ללבלב צריכה להתבצע בזהירות. תאים שנשפכו, מנקבים את הלבלב או פוצעים את הרקמה יכולים לגרום לתאים להשתרש באתרי איברים אחרים מחוץ ללבלב. הדבר עלול לסבך את ההערכה הקלינית (למשל, גודל וחדירה מקומית) של הגידול הראשוני, כמו גם את התפשטותו הגרורתית המקומית והרחוקה. לכן, מומלץ לתעד ולהעריך את היווצרות הבועות וכל מידע על דליפת תאים עבור כל עכבר מושתל. חתכים בעור ובצפק צריכים להיעשות בגודל מתאים כדי לאפשר גישה אופטימלית ללבלב תוך שמירה על הפצעים קטנים ככל האפשר.
ניתן להתאים את מספר התאים המושתלים בהתאם לתוכנית הניסוי. בעוד שמספר גדול יותר של תאים מושתלים מוביל לגידולים הגדלים במהירות פיזיולוגית ולהתקדמות מהירה של תסמינים קליניים, מספר תאים קטן יותר מגדיל את הסיכון שגידולים לא ייקלטו. יתר על כן, נפחים קטנים של מתלי תאים מומלצים מכיוון שנפחים גדולים יותר (>20 μL) קשורים לפוטנציאל מוגבר של היווצרות ליבה ציסטית13. מצאנו כי השתלת 2,500-5,000 תאים בנפח של 20 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים היא כמות אופטימלית למחקרים טיפוליים פרה-קליניים על ידי הבטחת צמיחת הגידול במשך מספר שבועות. עם זאת, עבור יישומים אחרים, ניתן להשתיל עד 1.6 × 106 תאים.
בנוסף למדיום תרבית התא, ניתן להשתמש במטריג'ל כמדיום עשיר בחומרים מזינים להשעיה מחדש של תאי PDAC, מה שגם מגביר את צמיגות תמיסת ההזרקה, ובכך מונע דליפה של תאי הגידול13. הזרקות לאזור הזנב של הלבלב עדיפות עם פרוטוקול זה מכיוון שזנב הלבלב נגיש בקלות והגישה לראש הלבלב מוגבלת. פרוטוקולים להזרקה מוצלחת של תאים לראש הלבלב מתוארים במקום אחר13,15. כדי לבצע את ההליך הכירורגי, עכברים נשמרים תחת analgosedation באמצעות שילוב סמים, כולל midazolam, medetomidin, ו fentanyl, כמו גם meloxicam כמו משכך כאבים לפני ואחרי הניתוח. לחלופין, isoflurane בשילוב עם משככי כאבים מתאימים יכול לשמש כהרדמה ממסים נדיפים תחת זרימה מתמדת. בחירת שיטת ההקצאה לרישיון בעל החיים תלויה בהנחיות המוסדיות וברשויות המקומיות בהתאמה.
בחירה זהירה של קווי התאים והעכברים המקבלים היא הכרחית. ואכן, חשוב לוודא שהרקע הגנטי של העכברים המקבלים תואם את הרקע הגנטי של קווי התאים שנבחרו כדי למנוע אימונוגניות ודחיית השתל של תאי PDAC. יתר על כן, חלבונים אקסוגניים אימונוגניים, כגון אללים פלואורסצנטיים או Cas9, המבוטאים על ידי תאי גידול מושתלים משפיעים על תגובת המארח ויכולים להוביל לתגובה אימונוגנית. לכן, צמיחת הגידול והרכב ה- TME יכולים להיות מושפעים ולגרום להטיה.
בהשוואה ל- GEMMs, אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של עכברים מראים כמות מופחתת של דסמופלזיה, ובמקרים מסוימים, שיעור נמוך יותר של הפצה גרורתית, המגביל, בין השאר, את הדמיון לגידולים אנושיים. יתר על כן, הצורך בהתערבות כירורגית מגביר את מורכבות ההליך. השתלות לא מוצלחות הגורמות להיעדר גידולי לבלב במיקום הרצוי עקב הזרקת תאים שאינם ברי קיימא, דחיית תאים מושתלים, מספר נמוך של תאים מוזרקים ודליפת הזרקה עלולים למנוע את השלמת הליך הניסוי.
למרות מגבלות אלה, מודלים סינגניים אורתוטופיים של PDAC הוכחו כמתמודדים ביעילות עם רבים מהאתגרים של חקר PDAC וההטרוגניות שלו. עם הפנוטיפים ודפוסי צמיחת הגידול שלהם הניתנים לשחזור רב, כמו גם אינטראקציות גידול-TME, הם מייצגים משאב שלא יסולא בפז שניתן להשיג במהירות בעקבות פרוטוקול פשוט יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למתקן בעלי החיים TUM ולמתקן ליבת ההדמיה של המחלקה לרפואה גרעינית, Klinikum rechts der Isar, על תמיכה טכנית מעולה. מחקר זה נתמך על ידי קונסורציום הסרטן הגרמני (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 ו-S01) ל-D.S., קרן וילהלם סנדר (2020.174.1 ו-2017.091.2) ל-D.S. ומועצת המחקר האירופית (ERC CoG מס' 648521, ל-D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
