Summary
Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.
Abstract
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença muito complexa, caracterizada por um microambiente tumoral heterogêneo composto por um estroma diverso, células imunes, vasos, nervos e componentes da matriz extracelular. Ao longo dos anos, diferentes modelos de ADP em camundongos foram desenvolvidos para enfrentar os desafios impostos por sua progressão, potencial metastático e heterogeneidade fenotípica. Aloenxertos ortotópicos imunocompetentes de PDAC em camundongos têm se mostrado promissores devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados. Além disso, combinados com sua capacidade de mimetizar as características biológicas observadas no ADP autóctone, modelos de camundongos aloenxertos ortotópicos baseados em linhagens celulares permitem experimentos in vivo em larga escala. Assim, esses modelos são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos para análises rápidas genótipo-fenótipo e resposta a drogas. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para injetar com sucesso culturas primárias de células PDAC em camundongos no pâncreas de camundongos receptores singênicos. Além dos detalhes técnicos, são dadas informações importantes que devem ser consideradas antes da realização desses experimentos.
Introduction
Recentemente, o ADP tornou-se a terceira causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental1. Causa a maior taxa de mortalidade entre todos os cânceres e uma taxa de sobrevida global de 10 anos de ~1%, que não mudou por décadas2. Devido à falta de progresso no tratamento do ADP, espera-se que essa doença se torne a segunda causa de mortes relacionadas ao câncer na próxima década3.
Os tumores PDAC são entidades complexas caracterizadas por um microambiente tumoral (ETM) diverso, composto por um conjunto heterogêneo de estroma, componentes vasculares, imunes e da matrizextracelular4. Diferenças na composição da ETM influenciam o prognóstico da doença e a resposta à terapia 4,5,6. De fato, muitos estudos têm demonstrado que o subtipo mesenquimal basal da ADP está associado a uma ETM altamente imunossupressora e apresenta diminuição da sobrevida e ausência de resposta às terapias7,8,9,10,11,12. Portanto, uma compreensão mais profunda das diferenças na composição da EMT e como essas características influenciam a biologia tumoral continua sendo um fator importante para o desenvolvimento de terapias molecularmente precisas. Para melhor compreender a biologia por trás desse fenótipo complexo e identificar estratégias terapêuticas capazes de superar a barreira que a ETM do ADP constitui, modelos in vivo são indispensáveis.
Um aspecto chave para qualquer sistema modelo pré-clínico de câncer é que ele deve mimetizar fenótipos humanos, recapitulando tanto a heterogeneidade genética quanto o meio incorporando a multiplicidade de populações estromais e imunes que compõem a TME. Portanto, ao escolher modelos de camundongos para pesquisa pré-clínica, vários aspectos devem ser levados em consideração. Para investigar a interação tumor-imune, linhagens histocompatíveis de células cancerosas podem ser injetadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Na maioria dos casos, estes são injetados por via subcutânea no flanco do rato, permitindo fácil monitorização tumoral por palpação ou inspeção visual. No entanto, os modelos resultantes não mimetizam o crescimento de células tumorais em seu órgão de origem. Portanto, o transplante ortotópico tornou-se o padrão-ouro para modelos de aloenxerto.
Os aloenxertos ortotópicos de camundongos apresentam várias vantagens: são custo-efetivos, podem ser gerados com um procedimento relativamente simples e resultam em modelos com composição molecular conhecida, bem como uma progressão tumoral e fenótipo reprodutível e previsível. De fato, enquanto os modelos de xenoenxerto derivados do paciente representam o comportamento das células PDAC humanas com precisão, a necessidade de implantação em camundongos imunodeficientes para evitar a rejeição do enxerto limita a análise das interações tumor-imune e tumor-estroma, permitindo que os pesquisadores capturem apenas uma imagem parcial da complexidade desses tumores. Os aloenxertos ortotópicos singênicos de ADP apresentam uma vantagem nesse sentido também em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Os GEMMs recapitulam com precisão a tumorigênese humana do ADP e a heterogeneidade observada em pacientes com ADP. No entanto, devido a essas características, os tumores GEMM podem apresentar alta variância em sua composição genética, progressão tumoral, agressividade, diferenciação histológica e composição da ETM. Embora isso possa ser uma vantagem em certos estudos, limita os estudos genótipo-fenótipo e a investigação focada dos fenótipos PDAC13. Portanto, aloenxertos ortotópicos de camundongos constituem um bom tradeoff e modelo para realizar estudos tumor-hospedeiro e tratamento in vivo. Este artigo descreve um protocolo para experimentos de transplante ortotópico de células PDAC murinas no pâncreas de camundongos.
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Protocol
Os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) das autoridades locais da Universidade Técnica de Munique e Regierung von Oberbayern.
1. Informações a considerar antes do procedimento
- Garantir a aprovação do protocolo animal e do pessoal pelas autoridades locais antes de iniciar qualquer experimentação animal.
- Selecione os mouses do destinatário.
- Selecionar camundongos de idades semelhantes para implantação (camundongos receptores C57Bl/6J com faixa etária entre 2 meses e 4 meses).
- Assegurar que o sexo e o background genético dos animais receptores correspondam ao sexo e ao background genético dos animais dos quais se originou a linhagem celular utilizada para a implantação (aloenxertos singênicos).
- Preparar os ratos para a implantação.
NOTA: Manusear os ratos de acordo com as normas de higiene do biotério local.- No dia do implante, não alimente os camundongos 4 h antes do procedimento para evitar complicações devido à administração de anestésicos.
- Pesar os ratos antes do implante para calcular a quantidade de anestésicos necessários.
- Transfira os ratos para a sala de cirurgia.
- Selecione as linhas de célula do PDAC.
- Certifique-se de que o fundo genético e o sexo dos camundongos dos quais as linhagens celulares são derivadas correspondam ao background e ao sexo dos camundongos receptores (por exemplo, as linhagens celulares PDAC PDAC 1-3 geradas anteriormente a partir de GEMMs PDAC em um fundo C57Bl/6J em laboratório com os seguintes genótipos, conforme descrito anteriormente14: PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Selecione as linhagens celulares que não expressam proteínas potencialmente imunogênicas.
- Cultura de linhagens celulares PDAC.
NOTA: Execute o trabalho de cultura de células sob uma capela de fluxo laminar. Desinfete as luvas, o espaço de trabalho e os materiais antes de trabalhar.- Descongelar as células 1 semana antes do implante ressuspendendo o pellet em 5 mL de meio de cultura celular. Gire as células, aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e girar as células novamente. Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de penicilina-estreptomicina (PS). Transfira a suspensão celular para um balão de 25 cm².
- Passar as linhagens celulares pelo menos uma vez antes da implantação.
- Retirar o meio celular, lavar 1x com PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina para retirar as células do frasco. Incubar as células a 37 °C até que se desprendam do balão (dependendo da linha celular, isto geralmente demora 5-10 min). Quando as células estiverem destacadas, ressuspendê-las em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um frasco de 75 cm².
NOTA: Como o FBS inativa a tripsina, isso dificultaria a tripsinização.
- Retirar o meio celular, lavar 1x com PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina para retirar as células do frasco. Incubar as células a 37 °C até que se desprendam do balão (dependendo da linha celular, isto geralmente demora 5-10 min). Quando as células estiverem destacadas, ressuspendê-las em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um frasco de 75 cm².
- Garantir confluência de ~70%-80% no dia da implantação.
- Material necessário para implantação
- Autoclave de todos os instrumentos cirúrgicos.
- Mantenha os anestésicos prontos com base na licença de experimentação animal.
- Use meloxicam para analgesia com pelo menos 5 min de antecedência como um analgésico de longa duração com propriedades anti-inflamatórias.
- Para cirurgia, use uma combinação de midazolam, medetomidina, e fentanil (MMF) para analgosedação.
- Use uma combinação de atipamezole, flumazenil e naloxona (AFN) para antagonizar a analgosedação do MMF após o implante.
- Prepare um campo estéril, uma esteira de aquecimento, um barbeador, luvas, creme para os olhos, cloreto de sódio a 0,9%, esfoliação cirúrgica à base de iodo ou clorexidina, etanol a 80%, sutura solúvel, clipes para feridas, seringa de volume de injeção de 50 μL e fita adesiva.
2. Preparação das linhagens celulares antes da implantação
NOTA: Prepare as células tumorais somente quando os camundongos estiverem prontos para implantação. Garantir um curto período de tempo entre a colheita ou coleta das células e a implantação.
- Aquecer todos os líquidos a 37 °C antes de usar.
- Preparar as células (a partir de 1x T75 (um balão de cultura de 75 cm 2) conforme descrito no passo 1.5.2.1 até se desprenderem do balão. Ressuspender as células em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
- Gire as células a 200 × g por 5 min em uma centrífuga. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em um volume adequado de DMEM sem aditivos com base na concentração final necessária das células para injeção. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células usando uma câmara de Neubauer e calcular o número de células disponíveis.
- Diluir as células até o número final necessário de células para injeção (por exemplo, 2.500 células em 20 μL) em DMEM sem aditivos. Transferir 1 ml da suspensão celular diluída para um tubo de 1,5 ml. Coloque o tubo em um rotador até o implante para evitar que as células se agreguem.
3. Implantação ortotópica de células PDAC
OBS: Em caso de experiência cirúrgica insuficiente, pratique primeiro com cadáveres e obtenha treinamento adequado, por exemplo, dentro de um protocolo de treinamento de animais. O pessoal que realiza a cirurgia e os experimentos com animais precisa atender aos critérios das respectivas autoridades e às diretrizes institucionais.
- Utilizar meloxicam como analgésico perioperatório e aplicar 5 mg/kg de peso corporal por via subcutânea.
- Injetar MMF por via intraperitoneal de acordo com o peso corporal de cada camundongo (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidina [0,5 mg/kg] e fentanil [0,05 mg/kg]).
- Coloque o mouse de volta na gaiola por 10-15 min.
- Aplique creme para os olhos quando o rato estiver a dormir.
- Verifique a analgosedação suficiente após 10 min, testando o reflexo de retirada do pedal (pinça nas almofadas dos pés de ambos os pés traseiros). Em caso de resposta, aplicar 1/3 da dose original de analgosedação. Após 10 min, repita o procedimento e prossiga apenas na ausência de um reflexo de retirada do pedal.
- Raspar o flanco abdominal lateral esquerdo do rato. Coloque o rato deitado do lado direito sobre um tapete de aquecimento estéril e tape as pernas na superfície. Desinfetar o abdome com uma esfoliação cirúrgica à base de iodo ou clorexidina, seguida de etanol 80% em movimento circular, e repetir o procedimento três vezes. Para manter a esterilidade do campo cirúrgico, use um campo cirúrgico.
- Use luvas novas e desinfete-as. Use tesoura cirúrgica para cortar a pele e o tecido adiposo subcutâneo longitudinalmente no flanco esquerdo, onde o baço é projetado. Realize um corte de cerca de 1 cm de comprimento.
- Usando tesoura e pinça, separe a pele do peritônio para facilitar o acesso ao peritônio.
- Troque o par de tesouras. Abra o peritônio no local do baço com um corte longitudinal de 1 cm.
- Mobilize o baço e o pâncreas aderido usando pinças rombas e de ponta fina. Certifique-se de que os órgãos não estão ligados a outros tecidos e verifique se há vasos sanguíneos para evitar ferir os vasos ou o tecido circundante ao manusear o pâncreas.
NOTA: Não pegue o baço diretamente para evitar sangramento. - Puxe cuidadosamente o pâncreas para fora da incisão para permitir um acesso mais fácil à cauda do órgão e observe o baço seguindo o pâncreas. Use a mão não dominante para agarrar o pâncreas com pinças e cortar cuidadosamente os ligamentos que impedem a extracorporalização do pâncreas. Certifique-se de que o órgão não é dobrado durante a injeção e que a cápsula do órgão é mantida sob tensão no local da penetração da agulha para evitar derramamento.
- Use a mão dominante para realizar a injeção. Penetre cuidadosamente na cápsula do órgão com a agulha da seringa seguindo o eixo longitudinal do órgão. Procure um pedaço de tecido pancreático entre os vasos sanguíneos visíveis para minimizar o risco de punção ou injeção em um vaso. Injetar lentamente um número adequado de células de acordo com o plano experimental (aqui, 2.500 células em 20 μL de DMEM) com uma cânula de 27 G e uma seringa de 50 μL na área da cauda do pâncreas.
NOTA: Uma bolha transparente se forma após a injeção bem-sucedida no tecido. - Mantenha o pâncreas e a seringa inserida imóvel por aproximadamente 1 min para evitar o derramamento das células tumorais. Retire cuidadosamente a agulha do local de injeção.
NOTA: Troque agulhas entre ratos e use uma nova seringa estéril para a injeção de uma nova linhagem celular. - Reorganize os órgãos dentro do abdômen cuidadosamente. Tome cuidado para não ferir o tecido para evitar o derramamento das células. Despeje 1 mL de cloreto de sódio a 0,9% sobre os órgãos para evitar a adesão do órgão.
- Suture cuidadosamente o peritônio usando a técnica de sutura interrompida simples e feche a pele com dois a três clipes de aço inoxidável de 9 mm.
NOTA: Remova os clipes da ferida 7 dias após o implante se a incisão cirúrgica tiver cicatrizado. - Se necessário, evitar a desidratação dos animais devido ao procedimento e à anestesia injetando 0,5 mL de cloreto de sódio por via subcutânea.
- Após o implante, antagoniza a analgosedação por MMF com injeção subcutânea de AFN (atipamezol [2,5 mg/kg], flumazenil [0,5 mg/kg], naloxon [1,2 mg/kg]), de acordo com o peso corporal do camundongo.
- Coloque o rato numa câmara aquecida a 37 °C até que esteja acordado e completamente activo. Em seguida, coloque o mouse de volta em sua gaiola original. Monitore o estado de saúde do mouse verificando o pelo, a cor da pele e a atividade e repita isso 3-4 h após a cirurgia.
4. Cuidados posteriores para os ratos
- Dê aos ratos acesso a água e comida quando voltarem à instalação animal.
- Continuar a aplicação subcutânea ou oral de meloxicam (5 mg/kg) a cada 6-12 h por 2-3 dias após a cirurgia.
- Monitorar o estado de saúde dos camundongos regularmente de acordo com o protocolo animal e as diretrizes institucionais.
- Dependendo do objetivo do experimento, monitore o crescimento do tumor a cada semana ou com mais frequência por meio de palpação, ultrassonografia, bioluminescência (BLI) ou ressonância magnética (RM).
NOTA: Com base no método de escolha, na taxa de crescimento e no número de células implantadas, um tumor pode ser detectado já 1 semana após a injeção.
5. Retirada de enxertos tumorais
- Colher os tumores ao final do experimento ou quando os camundongos precisarem ser eutanasiados seguindo os critérios dos comitês institucionais de cuidados e uso de animais ou licença de experimentação animal.
- Eutanásia do rato utilizando um método permitido pela licença de experimentação animal.
NOTA: Executar etapas com uma perda de tempo mínima para minimizar o tempo de isquemia. Portanto, a luxação cervical é recomendada, pois é um método rápido e o tempo de morte pode ser determinado exatamente, em contraste com o sangramento terminal ou métodos químicos. - Coloque o rato em decúbito dorsal sobre um tapete estéril e tape as pernas na superfície. Use etanol a 80% para desinfetar o abdômen.
- Use luvas novas e desinfete-as. Use tesoura cirúrgica para cortar a pele longitudinalmente no abdome central.
- Usando tesoura e pinça, separe a pele do peritônio para facilitar o acesso ao peritônio.
- Troque o par de tesouras. Abrir o peritônio no abdome central com corte longitudinal de 5 cm.
- Mobilize o baço e o pâncreas aderido usando pinças rombas e de ponta fina. Desprenda cuidadosamente o tumor do tecido circundante usando pinça e tesoura cirúrgica.
- Armazenar o tecido tumoral em um meio adequado para experimentos a jusante. Processar imediatamente os tecidos ou, se necessário, manter a amostra a 4 °C durante um máximo de 6 h até ao processamento posterior.
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Representative Results
No contexto de um estudo de resposta a drogas em larga escala, implantamos com sucesso mais de 170 camundongos (camundongos receptores C75Bl6/J, machos e fêmeas com sexo pareado às linhagens celulares PDAC injetadas) usando o protocolo descrito acima, exemplificado em suas principais etapas na Figura 112. Neste protocolo, implantamos ortotopicamente três linhagens de células PDAC KrasG12D (PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), que foram previamente gerados em laboratório. O enxerto de células PDAC pode ser palpado abdominalmente mais precocemente, aproximadamente 7 dias após a cirurgia, dependendo do número de células injetadas e das características de agressividade e crescimento da linhagem celular inoculada. A ressonância magnética (Figura 2A), a ultrassonografia e o IPB do abdome de camundongos podem ser usados para medidas quantitativas do volume tumoral. Dependendo das características intrínsecas das células tumorais das linhagens celulares, a sobrevida dos camundongos implantados resultantes pode variar (Figura 2B). Injeções intrapancreáticas bem-sucedidas levam a tumores completos no pâncreas de camundongos (Figura 2C,D). Em contraste, implantes malsucedidos podem resultar na ausência de tumores pancreáticos devido a) injeção de células inviáveis, b) rejeição das células implantadas (por exemplo, se as células não fossem singênicas ao camundongo receptor) ou c) um número insuficiente de células injetadas. Resultados negativos alternativos podem levar à ausência de um tumor primário no pâncreas, mas à presença de um tumor no peritônio, correspondente ao local de injeção (por exemplo, por meio do vazamento da suspensão de células tumorais do local de injeção pancreática).
Figura 1: Representação esquemática das principais etapas do protocolo . (A) As células PDAC devem ser passadas pelo menos uma vez antes do implante. (B) As células são tripsinizadas para descolá-las do frasco, transferidas para um tubo de 15 mL e contadas. (C) A diluição celular apropriada é colocada em um tubo e levada para a sala de implantação. (D) O camundongo receptor é anestesiado, tricoteado e desinfetado na região onde será realizada a cirurgia. (E) Um corte de 1 cm é feito no abdome do camundongo correspondente à localização da cauda do pâncreas. (F) O número desejado de células é injetado na cauda do pâncreas. Abreviação: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de resultados bem-sucedidos com aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos. (A) RNM representativa de um camundongo 2 semanas após o transplante ortotópico de células PDAC primárias de camundongo. Contorno tracejado denota o tumor. Barra de escala = 5 mm. (B) Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de três diferentes linhagens de células PDAC de camundongos (PDAC 1-3) transplantadas ortotopicamente para o pâncreas de camundongos imunocompetentes singênicos (fundo C57Bl/6J). (C) Imagem representativa de um tumor isolado no endpoint da linhagem celular PDAC1 injetada ortotopicamente. Tanto um tumor pancreático resultante de uma injeção intrapancreática bem-sucedida de células tumorais quanto o baço são mostrados na fotografia. Barra de escala = 5 mm. (D) Barplot representando o peso médio dos tumores transplantados ortotopicamente do PDAC 1-3. Os pontos representam ratos individuais. Abreviações: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático; RM = ressonância magnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos representam um modelo robusto para estudos pré-clínicos devido ao custo-efetividade, reprodutibilidade e procedimentos experimentais relativamentesimples13,15. Esses modelos não só permitem o estudo das interações tumor-hospedeiro, mas também garantem a preservação da heterogeneidade genética dos tumores de onde se originam quando culturas primárias de células de camundongo são utilizadas para o experimento.
Este protocolo apresenta um procedimento simples e rápido para a implantação ortotópica de culturas de células PDAC de camundongos no pâncreas. Para a obtenção de resultados reprodutíveis, várias considerações técnicas devem ser consideradas, incluindo a qualidade da técnica cirúrgica. Como as práticas cirúrgicas variam, é aconselhável que uma pessoa realize todas as injeções ortotópicas dentro do mesmo experimento.
A injeção de células no pâncreas deve ser realizada com cautela. Células derramadas, perfurando o pâncreas ou ferindo o tecido podem fazer com que as células enxertem em outros locais do órgão fora do pâncreas. Isso pode complicar a avaliação clínica (por exemplo, tamanho e infiltração local) do tumor primário, bem como sua disseminação metastática local e à distância. Portanto, recomenda-se documentar e avaliar a formação de bolhas e qualquer informação sobre derramamento celular para cada camundongo implantado. Os cortes na pele e no peritônio devem ser feitos em um tamanho adequado para permitir o acesso ideal ao pâncreas, mantendo as feridas o menor possível.
O número de células implantadas pode ser ajustado dependendo do plano experimental. Enquanto um número maior de células implantadas leva a tumores fisiologicamente de crescimento rápido e rápida progressão dos sintomas clínicos, números menores de células aumentam o risco de que os tumores não enxertem. Além disso, pequenos volumes de suspensões celulares são recomendados, pois volumes maiores (>20 μL) estão associados a um potencial aumentado de formação de um núcleo cístico13. Descobrimos que implantar 2.500-5.000 células em um volume de 20 μL de meio de cultura celular é uma quantidade ideal para estudos terapêuticos pré-clínicos, garantindo o crescimento do tumor ao longo de várias semanas. No entanto, para outras aplicações, até 1,6 × 106 células podem ser implantadas.
Além do meio de cultura celular, o Matrigel pode ser utilizado como meio rico em nutrientes para ressuspender as células PDAC, o que também aumenta a viscosidade da solução injetada, evitando o extravasamento das célulastumorais13. Injeções na área da cauda do pâncreas são preferidas com este protocolo, pois a cauda do pâncreas é facilmente acessível e o acesso à cabeça do pâncreas é limitado. Protocolos para injeção de células na cabeça do pâncreas com sucesso são descritos em outra publicação13,15. Para a realização do procedimento cirúrgico, os camundongos são mantidos sob analgosedação usando uma combinação de drogas, incluindo midazolam, medetomidina e fentanil, bem como meloxicam como analgésico peri e pós-operatório. Alternativamente, o isoflurano em combinação com analgésicos apropriados pode ser usado como anestesia inalatória sob fluxo constante. A escolha do método de analgosedação de escolha para a licença animal depende das diretrizes institucionais e das respectivas autoridades locais.
A escolha cuidadosa das linhagens celulares e dos camundongos receptores é imperativa. De fato, é importante garantir que o background genético dos camundongos receptores corresponda ao background genético das linhagens celulares selecionadas para evitar a imunogenicidade e a rejeição do enxerto das células PDAC. Além disso, proteínas exógenas imunogênicas, como alelos repórteres fluorescentes ou Cas9, expressas por células tumorais implantadas influenciam a resposta do hospedeiro e podem levar a uma reação imunogênica. Portanto, o crescimento tumoral e a composição da ETM podem ser afetados e causar viés.
Em comparação com os GEMMs, os aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos mostram uma quantidade reduzida de desmoplasia e, em alguns casos, uma menor taxa de disseminação metastática, limitando, em parte, a semelhança com tumores humanos. Além disso, a necessidade de intervenção cirúrgica aumenta a complexidade do procedimento. O insucesso dos implantes que resultem na ausência de tumores pancreáticos no local desejado devido à injeção de células inviáveis, à rejeição das células implantadas, ao baixo número de células injetadas e ao extravasamento da injeção podem impedir a realização do procedimento experimental.
Apesar dessas limitações, modelos de aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos de ADP têm demonstrado abordar efetivamente muitos dos desafios do estudo do ADP e sua heterogeneidade. Com seus fenótipos e padrões de crescimento tumoral altamente reprodutíveis, bem como interações tumor-TME, eles representam um recurso inestimável que pode ser obtido rapidamente seguindo um protocolo relativamente simples.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à instalação de animais TUM e à instalação de núcleo de imagem do Departamento de Medicina Nuclear, Klinikum rechts der Isar, pelo excelente suporte técnico. Este estudo foi apoiado pelo German Cancer Consortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 e S01) para D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 e 2017.091.2) para D.S., e pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC CoG No. 648521, para D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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