Summary
Syngenetische muis orthotopische allografts van pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) recapituleren de biologie, fenotypen en therapeutische reacties van ziektesubtypen. Vanwege hun snelle, reproduceerbare tumorprogressie worden ze veel gebruikt in preklinische studies. Hier tonen we gemeenschappelijke praktijken om deze modellen te genereren, waarbij syngenetische murine PDAC-culturen in de alvleesklier worden geïnjecteerd.
Abstract
Pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) is een zeer complexe ziekte die wordt gekenmerkt door een heterogene tumormicro-omgeving die bestaat uit een divers stroma, immuuncellen, bloedvaten, zenuwen en extracellulaire matrixcomponenten. In de loop der jaren zijn verschillende muismodellen van PDAC ontwikkeld om de uitdagingen aan te pakken die worden gesteld door de progressie, het metastatische potentieel en de fenotypische heterogeniteit. Immunocompetente muis orthotopische allografts van PDAC zijn veelbelovend gebleken vanwege hun snelle en reproduceerbare tumorprogressie in vergelijking met genetisch gemanipuleerde muismodellen. Bovendien, in combinatie met hun vermogen om de biologische kenmerken na te bootsen die worden waargenomen in autochtone PDAC, maken op cellijn gebaseerde orthotopische allograftmuismodellen grootschalige in vivo experimenten mogelijk. Deze modellen worden dus veel gebruikt in preklinische studies voor snelle genotype-fenotype- en geneesmiddelresponsanalyses. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbare en robuuste aanpak te bieden voor het succesvol injecteren van primaire muis PDAC-celculturen in de pancreas van syngenetische ontvangende muizen. Naast de technische details wordt belangrijke informatie gegeven die moet worden overwogen voordat deze experimenten worden uitgevoerd.
Introduction
Onlangs werd PDAC de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de westerse wereld1. Het veroorzaakt het hoogste sterftecijfer van alle kankers en een 10-jaars totale overlevingskans van ~ 1%, die al tientallen jaren niet is veranderd2. Vanwege het gebrek aan vooruitgang in de PDAC-behandeling, wordt verwacht dat deze ziekte de tweede belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen zal worden in het volgende decennium3.
PDAC-tumoren zijn complexe entiteiten die worden gekenmerkt door een diverse tumormicro-omgeving (TME) die bestaat uit een heterogene samenstelling van stroma-, vasculaire, immuun- en extracellulaire matrixcomponenten4. Verschillen in de samenstelling van de TME beïnvloeden de ziekteprognose en respons op therapie 4,5,6. Inderdaad, veel studies hebben aangetoond dat het basale, mesenchymale subtype van PDAC geassocieerd is met een zeer immunosuppressieve TME en een verminderde overleving en gebrek aan respons op therapieënvertoont 7,8,9,10,11,12. Daarom blijft een dieper begrip van de verschillen in TME-samenstelling en hoe deze kenmerken de tumorbiologie beïnvloeden een belangrijke factor voor de ontwikkeling van moleculair nauwkeurige therapieën. Om de biologie achter dit complexe fenotype beter te begrijpen en therapeutische strategieën te identificeren die in staat zijn om de barrière te overwinnen die de TME van PDAC vormt, zijn in vivo modellen onmisbaar.
Een belangrijk aspect voor elk preklinisch kankermodelsysteem is dat het menselijke fenotypen moet nabootsen, waarbij zowel de genetische heterogeniteit als het milieu de veelheid aan stromale en immuunpopulaties die deel uitmaken van de TME wordt samengevat. Daarom moet bij het kiezen van muismodellen voor preklinisch onderzoek rekening worden gehouden met verschillende aspecten. Om de tumor-immuuninteractie te onderzoeken, kunnen histocompatibele kankercellijnen worden geïnjecteerd in syngeneïsche immunocompetente muizen. In de meeste gevallen worden deze subcutaan geïnjecteerd in de flank van de muis, waardoor eenvoudige tumormonitoring door palpatie of visuele inspectie mogelijk is. De resulterende modellen bootsen echter niet de groei van tumorcellen in hun orgaan van oorsprong na. Daarom werden orthotopische transplantaties de gouden standaard voor allograftmodellen.
Orthotopische allografts bij muizen hebben verschillende voordelen: ze zijn kosteneffectief, kunnen worden gegenereerd met een relatief eenvoudige procedure en resulteren in modellen met bekende moleculaire make-up, evenals een reproduceerbare en voorspelbare tumorprogressie en fenotype. Inderdaad, terwijl patiënt-afgeleide xenograftmodellen het gedrag van menselijke PDAC-cellen nauwkeurig weergeven, beperkt de behoefte aan implantatie in immunodeficiënte muizen om transplantaatafstoting te voorkomen de analyse van de tumor-immuun- en tumor-stroma-interacties, waardoor onderzoekers slechts een gedeeltelijk beeld van de complexiteit van deze tumoren kunnen vastleggen. Syngenetische orthotopische allografts van PDAC hebben in dit opzicht ook een voordeel ten opzichte van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's). GEMM's vatten de menselijke PDAC-tumorigenese en de heterogeniteit waargenomen bij PDAC-patiënten nauwkeurig samen. Vanwege deze kenmerken kunnen GEMM-tumoren echter een hoge variantie vertonen in hun genetische samenstelling, tumorprogressie, agressiviteit, histologische differentiatie en TME-samenstelling. Hoewel dit een voordeel kan zijn in bepaalde studies, beperkt het genotype-naar-fenotypestudies en het gerichte onderzoek van PDAC-fenotypen13. Daarom vormen orthotopische allografts van muizen een goede afweging en model om tumor-gastheer- en behandelingsstudies in vivo uit te voeren. Dit artikel schetst een protocol voor orthotopische transplantatie-experimenten van muizen PDAC-cellen in de muispancreas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies (IACUCs) van de lokale autoriteiten van de Technische Universiteit van München en Regierung von Oberbayern.
1. Informatie waarmee voorafgaand aan de procedure rekening moet worden gehouden
- Zorg voor goedkeuring van het dierprotocol en personeel door de lokale autoriteiten voordat u met dierproeven begint.
- Selecteer ontvangermuizen.
- Selecteer muizen van vergelijkbare leeftijd voor implantatie (C57Bl/6J-ontvangermuizen met een leeftijdsbereik tussen 2 maanden en 4 maanden).
- Ervoor zorgen dat het geslacht en de genetische achtergrond van de ontvangende dieren overeenkomen met het geslacht en de genetische achtergrond van de dieren waarvan de voor implantatie gebruikte cellijn afkomstig is (syngenetische allografts).
- Bereid de muizen voor op implantatie.
OPMERKING: Behandel de muizen volgens de hygiënische normen van de lokale dierenfaciliteit.- Voer de muizen op de dag van implantatie niet 4 uur vóór de procedure om complicaties als gevolg van de toediening van anesthetica te voorkomen.
- Weeg de muizen voorafgaand aan de implantatie om de hoeveelheid van de benodigde anesthetica te berekenen.
- Breng de muizen over naar de operatiekamer.
- Selecteer de PDAC-cellijnen.
- Zorg ervoor dat de genetische achtergrond en het geslacht van de muizen waarvan de cellijnen zijn afgeleid, overeenkomen met de achtergrond en het geslacht van de ontvangende muizen (bijvoorbeeld de PDAC-cellijnen PDAC 1-3 die eerder zijn gegenereerd uit PDAC GEMM's op een C57Bl / 6J-achtergrond in het laboratorium met de volgende genotypen, zoals eerder beschreven14: PDAC 1 en 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- Selecteer de cellijnen die geen eiwitten tot expressie brengen die mogelijk immunogeen zijn.
- Kweek de PDAC-cellijnen.
OPMERKING: Voer het celkweekwerk uit onder een laminaire stromingskap. Desinfecteer de handschoenen, werkruimte en materialen voordat u gaat werken.- Ontdooi de cellen 1 week voor implantatie door de pellet opnieuw te suspenderen in 5 ml celkweekmedium. Spin de cellen af, zuig het supernatant op, resuspensie van de pellet in 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en spin de cellen opnieuw. Verwijder het supernatant en resuspensie de cellen in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% penicilline-streptomycine (PS). Breng de celsuspensie over in een kolf van 25 cm².
- Passeer de cellijnen minstens één keer voor de implantatie.
- Verwijder het celmedium, was 1x met PBS en voeg 0,5 ml trypsine toe om de cellen los te maken van de kolf. Incubeer de cellen bij 37 °C totdat ze loskomen van de kolf (afhankelijk van de cellijn duurt dit meestal 5-10 minuten). Wanneer de cellen zijn losgemaakt, resuspendeert u de cellen in 10 ml DMEM met 10% FBS en 0,1% PS en brengt u de celsuspensie over in een kolf van 75 cm².
OPMERKING: Aangezien FBS trypsine inactiveert, zou het trypsinisatie belemmeren.
- Verwijder het celmedium, was 1x met PBS en voeg 0,5 ml trypsine toe om de cellen los te maken van de kolf. Incubeer de cellen bij 37 °C totdat ze loskomen van de kolf (afhankelijk van de cellijn duurt dit meestal 5-10 minuten). Wanneer de cellen zijn losgemaakt, resuspendeert u de cellen in 10 ml DMEM met 10% FBS en 0,1% PS en brengt u de celsuspensie over in een kolf van 75 cm².
- Zorg voor een samenloop van ~70%-80% op de dag van implantatie.
- Materiaal dat nodig is voor implantatie
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten.
- Houd anesthetica klaar op basis van de dierproeflicentie.
- Gebruik meloxicam voor analgesie ten minste 5 minuten van tevoren als een langdurig analgeticum met ontstekingsremmende eigenschappen.
- Gebruik voor chirurgie een combinatie van midazolam, medetomidine en fentanyl (MMF) voor analgosedatie.
- Gebruik een combinatie van atipamezole, flumazenil en naloxon (AFN) voor antagonatie van de MMF-analgosedatie na implantatie.
- Bereid een steriel gordijn, een verwarmingsmat, een scheerapparaat, handschoenen, oogcrème, 0,9% natriumchloride, jodium of op chloorhexidine gebaseerde chirurgische scrub, 80% ethanol, oplosbare hechtdraad, wondclips, een spuit met injectievolume van 50 μL en tape voor.
2. De cellijnen voorbereiden voor implantatie
OPMERKING: Bereid de tumorcellen alleen voor als de muizen klaar zijn voor implantatie. Zorg voor een kort tijdsbestek tussen het oogsten of verzamelen van cellen en implantatie.
- Verwarm alle vloeistoffen voor gebruik tot 37 °C.
- Bereid de cellen (vanaf 1x T75 (een weekkolf van 75 cm 2) zoals beschreven in stap 1.5.2.1 voor totdat ze loskomen van de kolf. Resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM met 10% FBS en 0,1% PS en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 ml.
- Draai de cellen op 200 × g gedurende 5 minuten in een centrifuge. Zuig het supernatant op en resuspendien de celpellet in een voldoende volume DMEM zonder toevoegingen op basis van de vereiste eindconcentratie van de cellen voor injectie. Gebruik 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen met behulp van een Neubauer-kamer en bereken het aantal beschikbare cellen.
- Verdun de cellen tot het uiteindelijke vereiste aantal cellen voor injectie (bijv. 2.500 cellen in 20 μL) in DMEM zonder toevoegingen. Breng 1 ml van de verdunde celsuspensie over in een buis van 1,5 ml. Plaats de buis op een rotator tot de implantatie om te voorkomen dat de cellen aggregeren.
3. Orthotopische implantatie van PDAC-cellen
OPMERKING: Oefen bij onvoldoende chirurgische ervaring eerst met kadavers en krijg voldoende training, bijvoorbeeld binnen een trainingsprotocol voor dieren. Het personeel dat de operatie en de dierproeven uitvoert, moet voldoen aan de criteria van de respectieve autoriteiten en de institutionele richtlijnen.
- Gebruik meloxicam als een perioperatief analgeticum en breng 5 mg / kg lichaamsgewicht subcutaan aan.
- Injecteer MMF intraperitoneaal volgens het lichaamsgewicht van elke muis (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidine [0,5 mg/kg] en fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Plaats de muis terug in de kooi gedurende 10-15 minuten.
- Breng oogcrème aan als de muis slaapt.
- Controleer voldoende analgosedatie na 10 minuten door de pedaalterugtrekkingsreflex te testen (knijp op de voetzolen van beide achterpoten). In geval van een respons, breng 1/3 van de oorspronkelijke dosis analgosedatie aan. Herhaal na 10 minuten de procedure en ga alleen verder bij afwezigheid van een pedaalterugtrekkingsreflex.
- Scheer de linker laterale buikflank van de muis. Plaats de muis liggend aan de rechterkant op een steriele verwarmingsmat en plak zijn poten op het oppervlak. Desinfecteer de buik met behulp van een op jodium of chloorhexidine gebaseerde chirurgische scrub gevolgd door 80% ethanol in een cirkelvormige beweging en herhaal de procedure drie keer. Om de steriliteit van het chirurgische veld te behouden, gebruikt u een chirurgisch gordijn.
- Draag nieuwe handschoenen en desinfecteer ze. Gebruik een chirurgische schaar om de huid en het onderhuidse vetweefsel in de lengterichting op de linkerflank te knippen waar de milt wordt geprojecteerd. Voer een snede uit van ongeveer 1 cm lang.
- Scheid met behulp van een schaar en een tang de huid van het buikvlies om gemakkelijker toegang te krijgen tot het buikvlies.
- Vervang de schaar. Open het peritoneum ter plaatse van de milt met een lengtesnede van 1 cm.
- Mobiliseer de milt en de aangehechte alvleesklier met behulp van een stompe tang met fijne punt. Zorg ervoor dat de organen niet aan ander weefsel zijn bevestigd en controleer op het leveren van bloedvaten om te voorkomen dat de bloedvaten of het omliggende weefsel worden verwond bij het hanteren van de alvleesklier.
OPMERKING: Pak de milt niet direct vast om bloedingen te voorkomen. - Trek de alvleesklier voorzichtig uit de incisie om gemakkelijker toegang te krijgen tot de staart van het orgaan en observeer de milt die de alvleesklier volgt. Gebruik de niet-dominante hand om de alvleesklier met een tang vast te pakken en knip voorzichtig de ligamenten door die voorkomen dat de alvleesklier extracorporaliseert. Zorg ervoor dat het orgaan niet wordt gevouwen tijdens de injectie en dat de capsule van het orgaan onder spanning wordt gehouden op de plaats van naaldpenetratie om morsen te voorkomen.
- Gebruik de dominante hand om de injectie uit te voeren. Penetreer voorzichtig de capsule van het orgaan met de naald van de spuit en volg de lengteas van het orgaan. Streef naar een stukje pancreasweefsel tussen zichtbare bloedvaten om het risico op doorprikken of injecteren in een bloedvat te minimaliseren. Injecteer langzaam een voldoende aantal cellen volgens het experimentele plan (hier 2.500 cellen in 20 μL DMEM) met een canule van 27 G en een spuit van 50 μL in het staartgebied van de alvleesklier.
OPMERKING: Een transparante bel vormt zich bij succesvolle injectie in het weefsel. - Houd de alvleesklier en de ingebrachte spuit ongeveer 1 minuut stil om morsen van de tumorcellen te voorkomen. Verwijder de naald voorzichtig van de injectieplaats.
OPMERKING: Verwissel naalden tussen muizen en gebruik een nieuwe steriele spuit voor de injectie van een nieuwe cellijn. - Herschik de organen in de buik zorgvuldig. Zorg ervoor dat u het weefsel niet verwondt om morsen van de cellen te voorkomen. Giet 1 ml 0,9% natriumchloride op de organen om orgaanhechting te voorkomen.
- Hecht het buikvlies voorzichtig met behulp van de eenvoudige onderbroken hechttechniek en sluit de huid met twee tot drie 9 mm roestvrijstalen wondclips.
OPMERKING: Verwijder de wondclips 7 dagen na implantatie als de chirurgische incisie is genezen. - Voorkom indien nodig uitdroging van de dieren als gevolg van de procedure en de anesthesie door 0,5 ml natriumchloride subcutaan te injecteren.
- Na implantatie, antagoniseren van de analgosedatie door MMF met een subcutane injectie van AFN (atipamezol [2,5 mg / kg], flumazenil [0,5 mg / kg], naloxon [1, 2 mg / kg]), afhankelijk van het lichaamsgewicht van de muis.
- Plaats de muis in een verwarmde kamer van 37 °C totdat hij wakker en volledig actief is. Plaats de muis vervolgens terug in de oorspronkelijke kooi. Controleer de gezondheidsstatus van de muis door de vacht, huidskleur en activiteit te controleren en herhaal dit 3-4 uur na de operatie.
4. Nazorg voor de muizen
- Geef de muizen toegang tot water en voedsel wanneer ze terug zijn in de dierenfaciliteit.
- Ga door met subcutane of orale toediening van meloxicam (5 mg / kg) om de 6-12 uur gedurende 2-3 dagen na de operatie.
- Controleer de gezondheidstoestand van de muizen regelmatig volgens het dierprotocol en de institutionele richtlijnen.
- Afhankelijk van het doel van het experiment, controleert u de tumorgroei elke week of vaker door palperen, echografie, bioluminescentie (BLI) of magnetische resonantiebeeldvorming (MRI).
OPMERKING: Op basis van de methode van keuze, de groeisnelheid en het aantal geïmplanteerde cellen, kan een tumor al 1 week na de injectie worden gedetecteerd.
5. Tumortransplantaten oogsten
- Oogst de tumoren aan het einde van het experiment of wanneer de muizen moeten worden geëuthanaseerd volgens de criteria van de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissies of dierproeflicentie.
- Euthanaseer de muis met behulp van een methode die is toegestaan door de dierproefvergunning.
OPMERKING: Voer stappen uit met een minimaal tijdsverlies om de ischemietijd te minimaliseren. Daarom wordt cervicale dislocatie aanbevolen omdat het een snelle methode is en het tijdstip van overlijden precies kan worden bepaald, in tegenstelling tot terminale bloedingen of chemische methoden. - Plaats de muis liggend op een steriele mat en plak zijn poten op het oppervlak. Gebruik 80% ethanol om de buik te desinfecteren.
- Draag nieuwe handschoenen en desinfecteer ze. Gebruik een chirurgische schaar om de huid in de lengterichting op de centrale buik te knippen.
- Scheid met behulp van een schaar en een tang de huid van het buikvlies om gemakkelijker toegang te krijgen tot het buikvlies.
- Vervang de schaar. Open het peritoneum bij de centrale buik met een lengtesnede van 5 cm.
- Mobiliseer de milt en de aangehechte alvleesklier met behulp van een stompe tang met fijne punt. Maak de tumor voorzichtig los van het omliggende weefsel met behulp van een tang en een chirurgische schaar.
- Bewaar het tumorweefsel in een medium dat geschikt is voor downstream-experimenten. Verwerk de weefsels onmiddellijk of, indien nodig, bewaar het monster gedurende maximaal 6 uur op 4 °C totdat het verder wordt verwerkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het kader van een grootschalig geneesmiddelresponsonderzoek hebben we met succes meer dan 170 muizen geïmplanteerd (C75Bl6/J-ontvangende muizen, mannelijke en vrouwelijke muizengeslacht afgestemd op de geïnjecteerde PDAC-cellijnen) met behulp van het hierboven beschreven protocol, geïllustreerd in de belangrijkste stappen in figuur 112. In dit protocol hebben we orthotopisch drie KrasG12D-gedreven PDAC-cellijnen geïmplanteerd (PDAC 1 en 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), die eerder in het laboratorium werden gegenereerd. De transplantatie van PDAC-cellen kan het vroegst abdominaal worden gepalpeerd ongeveer 7 dagen na de operatie, afhankelijk van het geïnjecteerde celnummer en de agressiviteit en groeikenmerken van de geënte cellijn. MRI (figuur 2A), echografie en BLI van de buik van de muis kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve metingen van het tumorvolume. Afhankelijk van de intrinsieke kenmerken van de tumorcellen van de cellijnen, kan de overleving van de resulterende geïmplanteerde muizen variëren (figuur 2B). Succesvolle intrapancreasinjecties leiden tot volledige tumoren in de alvleesklier van de muis (figuur 2C, D). Daarentegen kunnen mislukte implantaties resulteren in de afwezigheid van pancreastumoren vanwege a) injectie van niet-levensvatbare cellen, b) afstoting van de geïmplanteerde cellen (bijvoorbeeld als de cellen niet syngenetisch waren voor de ontvangende muis), of c) een onvoldoende aantal geïnjecteerde cellen. Alternatieve negatieve uitkomsten kunnen leiden tot de afwezigheid van een primaire tumor in de alvleesklier, maar de aanwezigheid van een tumor in het peritoneum, overeenkomend met de injectieplaats (bijvoorbeeld door morsen van de tumorcelsuspensie van de pancreasinjectieplaats).
Figuur 1: Schematische weergave van de belangrijkste stappen van het protocol . (A) PDAC-cellen moeten ten minste eenmaal vóór implantatie worden gepasseerd. (B) Cellen worden trypsiniseerd om ze los te maken van de kolf, overgebracht naar een buis van 15 ml en geteld. (C) De juiste celverdunning wordt in een buis geplaatst en naar de implantatiekamer gebracht. (D) De ontvangende muis wordt verdoofd, geschoren en gedesinfecteerd in de regio waar de operatie zal plaatsvinden. (E) Er wordt een snede van 1 cm gemaakt in de buik van de muis die overeenkomt met de plaats van de staart van de alvleesklier. (F) Het gewenste aantal cellen wordt geïnjecteerd in de staart van de alvleesklier. Afkorting: PDAC = ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van succesvolle uitkomsten op syngenetische muis orthotopische allografts. (A) Representatieve MRI van een muis 2 weken na orthotopische transplantatie van primaire muis PDAC-cellen. Onderbroken omtrek duidt op de tumor. Schaalbalk = 5 mm. (B) Kaplan-Meier overlevingscurve van drie verschillende PDAC-cellijnen van muizen (PDAC 1-3) orthotopisch getransplanteerd in de pancreas van syngene immunocompetente muizen (C57Bl/6J-achtergrond). (C) Representatief beeld van een tumor geïsoleerd op eindpunt van de orthotopisch geïnjecteerde PDAC1-cellijn. Zowel een pancreastumor als gevolg van een succesvolle intrapancreasinjectie van tumorcellen als de milt zijn op de foto te zien. Schaalbalk = 5 mm. (D) Barplot met de gemiddelde tumorgewichten van orthotopisch getransplanteerde tumoren van PDAC 1-3. Stippen vertegenwoordigen individuele muizen. Afkortingen: PDAC = ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier; MRI = magnetische resonantie beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syngenetische orthotopische allografts bij muizen vormen een robuust model voor preklinische studies vanwege hun kosteneffectiviteit, reproduceerbaarheid en relatief eenvoudige experimentele procedures13,15. Deze modellen maken niet alleen de studie van tumor-gastheerinteracties mogelijk, maar garanderen ook het behoud van de genetische heterogeniteit van de tumoren waaruit ze afkomstig zijn wanneer primaire muiscelculturen voor het experiment worden gebruikt.
Dit protocol presenteert een eenvoudige en snelle procedure voor de orthotopische implantatie van muis PDAC-celculturen in de alvleesklier. Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, moeten verschillende technische overwegingen in gedachten worden gehouden, waaronder de kwaliteit van de chirurgische techniek. Omdat chirurgische praktijken variëren, is het raadzaam dat één persoon alle orthotopische injecties binnen hetzelfde experiment uitvoert.
De injectie van cellen in de alvleesklier moet met voorzichtigheid worden uitgevoerd. Gemorste cellen, het doorboren van de alvleesklier of het verwonden van het weefsel kunnen ervoor zorgen dat de cellen op andere orgaanplaatsen buiten de alvleesklier worden geënt. Dit kan de klinische evaluatie (bijv. grootte en lokale infiltratie) van de primaire tumor bemoeilijken, evenals de lokale en verre metastatische verspreiding. Daarom wordt aanbevolen om bellenvorming en alle informatie over het morsen van cellen voor elke geïmplanteerde muis te documenteren en te beoordelen. Snijwonden in de huid en het buikvlies moeten op een geschikte grootte worden gemaakt om optimale toegang tot de alvleesklier mogelijk te maken en tegelijkertijd de wonden zo klein mogelijk te houden.
Het aantal geïmplanteerde cellen kan worden aangepast afhankelijk van het experimentele plan. Terwijl grotere aantallen geïmplanteerde cellen leiden tot fysiologisch snel groeiende tumoren en snelle progressie van klinische symptomen, verhogen kleinere celaantallen het risico dat tumoren niet zullen transplanteren. Bovendien worden kleine volumes celsuspensies aanbevolen omdat grotere volumes (>20 μL) geassocieerd zijn met een verhoogd potentieel voor de vorming van een cystische kern13. We ontdekten dat het implanteren van 2.500-5.000 cellen in een volume van 20 μL celkweekmedium een optimale hoeveelheid is voor preklinische therapeutische studies door tumorgroei gedurende meerdere weken te garanderen. Voor andere toepassingen kunnen echter tot 1,6 × 106 cellen worden geïmplanteerd.
Naast celkweekmedium kan Matrigel worden gebruikt als een voedingsrijk medium om de PDAC-cellen te resuspenderen, wat ook de viscositeit van de injectieoplossing verhoogt, waardoor lekkage van de tumorcellen wordt voorkomen13. Injecties in het staartgebied van de alvleesklier hebben de voorkeur met dit protocol omdat de alvleesklierstaart gemakkelijk toegankelijk is en de toegang tot de pancreaskop beperkt is. Protocollen om met succes cellen in de alvleesklierkop te injecteren worden elders beschreven13,15. Om de chirurgische procedure uit te voeren, worden muizen onder analgosedatie gehouden met behulp van een medicijncombinatie, waaronder midazolam, medetomidine en fentanyl, evenals meloxicam als een peri- en postoperatief analgeticum. Als alternatief kan isofluraan in combinatie met geschikte analgetica worden gebruikt als inhalatie-anesthesie onder constante stroom. De keuze van de analgosedatiemethode voor de diervergunning hangt af van de institutionele richtlijnen en de respectieve lokale autoriteiten.
Een zorgvuldige keuze van de cellijnen en ontvangende muizen is noodzakelijk. Het is inderdaad belangrijk om ervoor te zorgen dat de genetische achtergrond van de ontvangende muizen overeenkomt met de genetische achtergrond van de geselecteerde cellijnen om immunogeniciteit en transplantaatafstoting van de PDAC-cellen te voorkomen. Bovendien beïnvloeden immunogene exogene eiwitten, zoals fluorescerende reporter-allelen of Cas9, uitgedrukt door geïmplanteerde tumorcellen, de reactie van de gastheer en kunnen ze leiden tot een immunogene reactie. Daarom kunnen tumorgroei en de samenstelling van de TME worden beïnvloed en vertekening veroorzaken.
In vergelijking met GEMM's vertonen syngenetische orthotopische muis-allografts een verminderde hoeveelheid desmoplasie en, in sommige gevallen, een lagere mate van metastatische verspreiding, waardoor de gelijkenis met menselijke tumoren gedeeltelijk wordt beperkt. Bovendien verhoogt de noodzaak van chirurgische interventie de complexiteit van de procedure. Mislukte implantaties die resulteren in de afwezigheid van pancreastumoren op de gewenste locatie als gevolg van niet-levensvatbare celinjectie, de afstoting van geïmplanteerde cellen, lage aantallen geïnjecteerde cellen en injectielekkage kunnen de voltooiing van de experimentele procedure voorkomen.
Ondanks deze beperkingen is aangetoond dat syngenetische orthotopische muis allograft-modellen van PDAC veel van de uitdagingen van het bestuderen van PDAC en de heterogeniteit ervan effectief aanpakken. Met hun zeer reproduceerbare fenotypes en tumorgroeipatronen, evenals tumor-TME-interacties, vertegenwoordigen ze een onschatbare hulpbron die snel kan worden verkregen volgens een relatief eenvoudig protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We willen de TUM-dierenfaciliteit en de beeldvormingskernfaciliteit van de afdeling Nucleaire Geneeskunde, Klinikum rechts der Isar, bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het German Cancer Consortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 en S01) aan D.S., de Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 en 2017.091.2) aan D.S., en de European Research Council (ERC CoG No. 648521, to D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
