Summary
Buradaki amaç, kardiyovasküler hastalıklarda dysbiosis mekanizmalarını araştırmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektir. Bu yazıda, murin dışkı örneklerinin aseptik olarak nasıl toplanacağı ve nakledileceği, bağırsakların nasıl izole edileceği ve "Swiss-roll" yönteminin nasıl kullanılacağı, ardından gastrointestinal sistemdeki değişiklikleri sorgulamak için immün boyama teknikleri tartışılmaktadır.
Abstract
Bağırsak mikrobiyota dysbiosis, kardiyovasküler ve metabolik bozuklukların patofizyolojisinde rol oynar, ancak mekanizmaları iyi anlaşılmamıştır. Fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT), hastalık patofizyolojisinde total mikrobiyota veya izole türlerin doğrudan rolünü tanımlamak için değerli bir yaklaşımdır. Tekrarlayan Clostridium difficile enfeksiyonu olan hastalar için güvenli bir tedavi seçeneğidir. Preklinik çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasını manipüle etmenin, dysbiosis ve hastalık arasındaki mekanik bağlantıyı incelemek için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Fekal mikrobiyota transplantasyonu, kardiyometabolik hastalıkların yönetimi ve tedavisi için yeni bağırsak mikrobiyota hedefli terapötiklerin aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Kemirgenlerde yüksek başarı oranına rağmen, transplantasyonla ilişkili translasyonel değişiklikler devam etmektedir. Buradaki amaç, bağırsak mikrobiyomunun deneysel kardiyovasküler hastalıklardaki etkilerini incelemede rehberlik etmektir. Bu çalışmada, murin çalışmalarında fekal mikrobiyotanın toplanması, işlenmesi, işlenmesi ve transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Toplama ve işleme adımları hem insan hem de kemirgen donörleri için açıklanmıştır. Son olarak, kardiyovasküler hastalıklarda ve ilgili bağırsak mikrobiyota mekanizmalarında bağırsaklara özgü morfoloji ve bütünlük değişikliklerini değerlendirmek için İsviçre yuvarlanma ve immün boyama tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanmayı tanımladık.
Introduction
Kalp hastalığı ve inme de dahil olmak üzere kardiyometabolik bozukluklar, önde gelen küresel ölüm nedenleridir1. Fiziksel hareketsizlik, yetersiz beslenme, ilerleyen yaş ve genetik bu hastalıkların patofizyolojisini modüle etmektedir. Biriken kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının tip 2 diyabet2, obezite3 ve hipertansiyon4 dahil olmak üzere kardiyovasküler ve metabolik bozuklukları etkilediği kavramını desteklemektedir ve bu da bu hastalıklar için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde bir anahtar tutabilir.
Mikrobiyotanın hastalıklara neden olduğu kesin mekanizmalar hala bilinmemektedir ve mevcut çalışmalar kısmen metodolojik farklılıklar nedeniyle oldukça değişkendir. Fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT), hastalık patofizyolojisinde total mikrobiyota veya izole türlerin doğrudan rolünü tanımlamak için değerli bir yaklaşımdır. FMT, hayvan çalışmalarında bir fenotipi indüklemek veya bastırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, kalori alımı ve glikoz metabolizması, dışkı maddesinin hasta bir donörden sağlıklı bir alıcıya aktarılmasıyla modüle edilebilir 5,6. İnsanlarda, FMT'nin tekrarlayan Clostridium difficile enfeksiyonu olan hastalar için güvenli bir tedavi seçeneği olduğu gösterilmiştir7. Kardiyovasküler hastalık yönetiminde kullanımını destekleyen kanıtlar ortaya çıkmaktadır; Örneğin, yağsız ve metabolik sendromlu hastalardan FMT, insülin duyarlılığını artırır8. Bağırsak dysbiosis ayrıca hem insan hem de kemirgen çalışmalarında yüksek tansiyon ile ilişkilidir 9,10,11. Mikropsuz farelere yüksek tuzlu bir diyetle beslenen farelerden elde edilen FMT, alıcıları inflamasyona ve hipertansiyona yatkınlaştırır12.
Kemirgenlerde FMT başarısının yüksek oranına rağmen, translasyonel zorluklar devam etmektedir. Obezite ve metabolik sendromu tedavi etmek için FMT kullanan klinik çalışmalar, bu bozukluklar üzerinde minimal veya hiç etki göstermemektedir13,14,15. Bu nedenle, kardiyometabolik bozuklukların tedavisi için bağırsak mikrobiyotasını hedef alan ek terapötik yolları tanımlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bağırsak mikrobiyotası ve kardiyovasküler hastalık ile ilgili mevcut kanıtların çoğu ilişkiseldir. Açıklanan protokol, hem hastalık hem de bağırsak mikrobiyotası arasındaki ilişkiyi göstermek ve bağırsak bağırsağının tüm bölümlerinin bütünlüğünü doğrudan değerlendirmek için FMT ve İsviçre yuvarlanma tekniğinin bir kombinasyonunun nasıl kullanılacağını tartışmaktadır16,17,18.
Bu yöntemin genel amacı, bağırsak mikrobiyomunun deneysel kardiyovasküler hastalıklardaki etkilerini incelemek için rehberlik sağlamaktır. Bu protokol, fizyolojik çeviriyi teşvik etmek ve bulguların titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için deneysel tasarımda daha fazla ayrıntı ve önemli hususlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, bu makalede açıklanan tüm prosedürleri onayladı. Jackson Laboratuvarı'ndan satın alınan 3 aylıkken C57B1/6 erkek fareler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak barındırıldı ve bakımı yapıldı.
1. İnsan dışkı örneklerinin toplanması, depolanması ve işlenmesi
- Denek klinikteyse steril bir kap kullanarak bir dışkı örneği toplayın. Dışkı numunelerini, işleme hazır olana kadar toplandıktan sonraki 36 saat içinde 4 °C'de soğutun. Alternatif olarak, özellikle evde kullanım için, ortam sıcaklığında kolay ve genişletilmiş DNA stabilitesi için piyasada bulunan bir araç kullanarak dışkı örnekleri toplayın.
- Biyogüvenlik seviyesindeki bir duman davlumbazını %10'luk bir ağartıcı çözeltisi veya Çevre Koruma Ajansı onaylı başka bir dezenfektan ile sterilize edin.
- Dışkıyı soğuk depolamadan çıkarın ve duman davlumbazına getirin; ~ 1 g alikot yapmak için tek kullanımlık bir spatula kullanın ve işleme için tamamen hazır olana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
- Tüm tek kullanımlık eşyaları biyolojik tehlike çöpüne atın. Tüm yüzeyleri (başlık ve işlemcinin dokunduğu tüm yüzeyler) ve kaputtan çıkarılan öğeleri dezenfekte edin.
2. Fare dışkı örneklerinin aseptik toplanması
NOT: Sterilize edilmiş aletler de dahil olmak üzere aseptik teknikler kullanın.
- CO2 boğulma ile fareyi ötenazi yapın. Farenin göğsüne ve yanlarına% 70 etanol püskürtün ve gastrointestinal sistemi açığa çıkarmak için cildi ve periton boşluğunu dikkatlice açın.
- Çekumu izole edin ve ikiye bölmek için steril cerrahi makas kullanın. Kısaca, çekumu açığa çıkarın ve ileumdan 0.5 cm proksimal olarak ve kolon ile birleşme noktasında distal olarak 0.5 cm kesin. İzole çekumu steril bir Petri kabına aktarın.
- Çekal içeriğini steril tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın ve alikotları -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın19.
NOT: Bağırsaktaki bakterilerin çoğunluğu anaeroblar olduğundan, oksijene maruz kalmak, bir oda atmosferinde izolasyon prosedürü sırasında organizmalara zarar verebilir veya öldürebilir. Bu nedenle, dışkı örnekleri, bakterilerin yaşayabilirliğini korumak için anaerobik odalarda izole edilmelidir.
3. Fekal madde nakli
- Taze veya önceden dondurulmuş dışkı peletlerini steril salin içinde 1:20 (w:v) oranında ve vortekste homojenize edilene kadar tekrar askıya alın.
- Büyük partikül maddeleri gidermek için homojenatı 30 μm gözenekli naylon filtreden geçirin. 5 dakika boyunca 79 × g'da santrifüj yapın ve transplantasyon için kullanmak üzere süpernatantı toplayın.
- Ardışık 3 gün boyunca mikropsuz alıcı fare başına bulamacın 100 μL'sini oral gavaj, ardından 2 hafta boyunca her 3 günde bir gavaj. Alıcının kendi endemik mikrobiyotasını ortadan kaldırmak için ilk önce antibiyotiklerle tedavi edilmişlerse, bağırsak mikrobiyotasının mekanizmalarını incelemek için geleneksel fareleri kullanın. Örneğin, dışkı bulamacının gavajından önce oral gavaj ile alıcı farelere günde 5 gün boyunca seftriakson (400 mg / kg) uygulayın.
NOT: Çalışmalar, kan basıncı20 de dahil olmak üzere kardiyovasküler değişiklikleri ortaya çıkarmak için bu tedavinin en az 2 haftasının gerekli olduğunu göstermektedir. - Mikropsuz alıcı farelerin gnotobiyotik film izolatörlerinde tek barındırıldığından ve steril yiyecek ve su ile beslendiğinden emin olun.
4. Sistolik kan basıncı ölçümleri
NOT: Geleneksel olarak barındırılan 3 aylık C57Bl/6 farelerden FMT alan gnotobiyotik farelere, 2 hafta boyunca düşük doz anjiyotensin II (140 ng/kg/dak) infüzyonu için ozmotik mini pompalar (Alzet, model 2002) implante edildi. Kan basıncı kuyruk manşeti ile haftalık olarak izlendi. Ozmotik mini pompaların implante edilmesi için protokol daha önce bildirilmiştir21. Kuyruk manşeti aşağıda kısaca özetlendiği gibi yapılmıştır. Kuyruk manşeti gibi kan basıncını ölçmek için invaziv olmayan bir yöntem, gnotobiyotik farelerde FMT çalışmaları için uygundur. Kuyruk manşetinin nasıl yapılacağına dair ayrıntılı adımlar daha önce açıklanmıştır22.
- Kısaca, fareleri gnotobiyotik izolatörlerden alın ve kuyruk manşet makinesi platformunu ve fare tutucuyu önceden ısıtın.
- Bilinçli fareleri ısıtılmış platformdaki kısıtlamalara yerleştirin ve kuyruk manşeti pletismografisini kullanarak en az üç tur sistolik basınç ölçümü toplayın. Stresi azaltmak amacıyla fareleri kısıtlanmaları için eğitmek üzere uygun ölçüm günlerinden art arda 3 gün önce aşağıdaki adımları uygulayın.
- Fareyi yavaşça önceden ısıtılmış tutucuya yerleştirin ve kuyruğu dışarıda bırakın. Fareyi zorlamamak için sıkıştırmadan üstünü dikkatlice bantlayın.
- Farenin tutucuda durmasına izin verin; Alışmak için bir tabaka ile kaplı 3-5 dakika boyunca platforma yerleştirin.
- Her hayvan için ortalama bir sistolik basınç için tüm turlardan elde edilen ölçümlerin ortalaması.
5. FMT'nin kardiyovasküler değişikliklere göre değerlendirilmesi
- Kan basıncı ölçümünü takiben, fareleri ötenazi yapın ve bölüm 2'de açıklandığı gibi çekal içeriklerini aseptik olarak toplayın.
- Bağırsak mikrobiyotasının kardiyometabolik sağlıktaki rolünü incelemek için bağırsakları ve kalp, aort, karaciğer, mezenterik arterler ve böbrekler dahil olmak üzere diğer dokuları toplayın. Dokuları hasat etmek için, faredeki dokuyu bulun ve bunları çıkarmak için makas kullanın.
- FMT23'ten sonra bağırsak mikrobiyotasının engraftasyonunu doğrulamak için donör ve alıcı farelerden toplanan dışkı örnekleri / çekal içerikleri üzerinde metagenomik bir dizileme analizi yapın. Mikrobiyotanın başarılı kolonizasyonunun ilk kanıtı, donör ve alıcının mikrobiyotasının benzer olduğunu doğrulamaktır.
- Morfolojik ve hücresel ekspresyon değişikliklerini incelemek için immünoboyama ve histoloji ile birlikte hasat edilen bağırsak dokusu üzerinde Swiss-roll tekniğini (bakınız bölüm 6) kullanın24.
6. Bağırsak bağırsağı İsviçreli rulolar yapmak
- 1. Gün
- % 70 etanol ile püskürtülen uygun şekilde ötenazi yapılmış bir farede, fare bağırsağını anal taraftan (retroperitoneumda sabitlenmiş) mide tarafına disseke edin. İzole gastrointestinal sistemin tamamını fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin. Proksimal ucu mide ucundan yavaşça tutun ve çevresindeki yağ ve bağ dokusunu elle çıkarın.
- İnce bağırsağı (ekten) izole edin ve her uzunlukta Z tipi zikzak yapın. Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi duodenum, jejunum ve ileumu art arda elde etmek için kesin25. Bağırsağın çekumun altındaki bölümünü keserek kolonu izole edin.
- Duodenum, jejunum, ileum ve kolonu kesin.
- Bağırsağı yırtmamak için PBS'yi bir şırınga ve top uçlu bir iğne ile kullanarak bağırsağı yıkayın ve yıkayın.
- Bağırsağı filtre kağıdına koyun. Kağıdı bölümün adıyla (örneğin, duodenum) etiketleyin ve ardından proksimal için sağ üst köşede 'P' veya sağ alt köşede distal için 'D' olarak etiketleyin.
- Bağırsağı bilyalı uçlu makasla uzunlamasına kesin. Filtre kağıdındaki bağırsağı açın. Gerektiğinde daha fazla PBS ile yıkayın.
- Bağırsağı iki filtre kağıdı arasına sıkıştırın. Filtre kağıtlarını bağırsağın yakınındaki dört noktadan / köşeden zımbalayın.
- % 10 formalin nötr tampon çözeltisine (4.0 g sodyum fosfat, monobazik, 6.5 g sodyum fosfat, dibazik,% 37 formaldehit, 900 mL damıtılmış su) batırın. Gece boyunca oda sıcaklığında 5 rpm'de bir platform rocker kullanarak çalkalayın.
- 2. Gün
- Damıtılmış suda% 2 agaroz hazırlayın ve alüminyum folyo ile kaplı bir beher içinde bir karıştırma çubuğu ile ısıtın.
- Dokuları almak; Üst filtre kağıdını sıyırın. Bağırsağı proksimal taraftan yuvarlayın, böylece proksimal taraf önce içeri girer ve lümen slaytta da içeride olacak şekilde içe doğru yuvarlayın. Gerektiğinde 30 G iğne veya iki ile sabitleyin.
- Tek kullanımlık lisansüstü transfer pipetleri kullanarak 1 mL agarozu aspire edin ve dokulardaki hava kabarcıklarını önlerken agarozu düz bir yüzeyde haddelenmiş bir bağırsak bölümüne dökün.
- Agarozun soğumasına ve katılaşmasına izin verin. Doku bölümünün etrafındaki ekstra agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
- Bağırsak bölümlerini doku işleme / gömme kasetlerine koyun (agaroz nedeniyle artan yüksekliği karşılamak için normal olanlardan daha büyük). 4 °C'de %70 etanol içine batırın.
- Parafine gömülü doku slaytları hazırlayın ve aşağıda belirtildiği gibi immün boyamaya devam edin.
7. Bağırsak bağırsak sisteminin immün boyaması
- Deparafinizasyon
- Bir rafta slaytlarla aşağıdaki banyolardan geçin: 3 dakika boyunca ksilen, 3 dakika boyunca tekrar taze ksilen, 3 dakika boyunca% 100 etanol (1: 1) içeren ksilen, 3 dakika boyunca% 95 etanol, 3 dakika boyunca% 70 etanol ve 3 dakika boyunca% 50 etanol.
- Soğuk akan musluk suyuyla hafifçe durulayın. Musluk suyu banyosunda saklayın.
- Antijen geri kazanımı
- Deparafinizasyonu takiben, slaytları 20 dakika boyunca 100 ° C'de antijen geri kazanım tamponu banyosunda (pH 6'da 0.01M trisodyum sitrat dihidrat ve% 0.05 Ara-20) bir rafta kaynatın.
- Soğuk musluk suyu altında çalıştırın.
- Boy -ama
- Slaytları banyodan çıkarın ve mendili altta ıslak laboratuvar mendilleri / kağıt havlular bulunan bir slayt kutusuna yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Hidrofobik bir işaretleyici kalemle dokunun etrafına bir anahat çizin.
- Tris tamponlu salin (TBS) +% 0.025 Triton X-100'ü dokuya bırakın ve 5 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımı yineleyin.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca TBS +% 10 fetal sığır serumu (FBS) +% 1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. Slaytları yan taraflarına çevirin ve laboratuvar mendilindeki engelleme tamponunu çıkarın.
- Birincil antikor çözeltisi ekleyin ve en az 2 saat veya bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. TBS +% 0.025 Triton X-100 ile hafifçe yıkayın, bölümün üzerine ~200 μL hafifçe pipetleyin.
- İkincil antikor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Slaytları TBS ile 3 x 5 dakika durulayın, adım 7.3.4'te olduğu gibi pipetle durulayın.
- Montaj ortamı ve bir kapak kayması ile monte edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir. Fare çekal içeriği veya insan dışkısı, mikropsuz farelere (100 μL) gavage ile verilecek bir bulamaç hazırlamak için steril salin içinde yeniden askıya alınır, önce art arda 3 gün, sonra her 3 günde bir. Protokolün sonunda, kan basıncı kuyruk-manşet yöntemiyle ölçülür, fareler ötenazi yapılır ve bağırsak mikrobiyotasındaki değişikliklerin ve kardiyovasküler ve metabolik değişikliklerin değerlendirilmesi için dokular toplanır.
Mikrobiyota seçiminde önemli bir adım, ilgilenilen hastalık fenotipinin donörde mevcut olmasını ve disbiyotik değişikliklerle ilişkili olmasını sağlamaktır. Örneğin, yüksek tuzlu bir diyet, dysbiosis ve kardiyovasküler disfonksiyon ile güçlü bir şekilde bağlantılıdır. Bu çalışmada,% 8'lik bir NaCl diyeti ile beslenen bir fare donörü kullanılmıştır. Yüksek tuza yanıt olarak bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikler, normal tuz mikrobiyotasından ayrı olarak kümelenen bakteriyel biyoçeşitlilikte (Şekil 2A) bir azalma içeriyordu (Şekil 2B). Firmicutes/Bacteroidetes oranı da artmıştır (Şekil 2C), bu da yüksek tuza bağlı mikrobiyota değişikliklerini düşündürmektedir (Ferguson ve ark.12'den modifiye edilmiştir).
Yüksek tuza bağlı dysbiosis'in hipertansiyona yatkınlıktaki rolünü belirlemek için, yüksek tuzla beslenen farelerden mikropsuz farelere FMT uygulandı ve anjiyotensin II'nin (Ang II) düşük subpresör dozuna kan basıncı yanıtları değerlendirildi. Bu çalışmada 3 aylıkken C57BL/6 erkek fareler kullanıldı. Alıcı farelere, farelerde 2 hafta boyunca sürekli düşük dozda Ang II (140 ng / kg / ) uygulamak için ozmotik mini pompalar implante edildi. Yüksek tuzla beslenen donörlerden FMT alan fareler, normal tuz mikrobiyota alıcılarına kıyasla Ang II tedavisi ile kan basıncında anlamlı bir artış göstermiştir (Şekil 3). Bu bulgu, FMT'nin alıcı fareleri hipertansiyon geliştirmeye hazırladığını göstermektedir12. Kemirgenlerde kuyruk manşeti protokolü ile ilgili detaylar daha önce12,26 bildirilmiştir.
Disbiyotik bağırsak mikrobiyotası, kısmen iltihaplı ve sızdıran bir bağırsak duvarı nedeniyle hastalığa katkıda bulunur. Bu nedenle, bağırsak duvarının immünohistokimya ile incelenmesi, FMT'nin ötesinde bile herhangi bir hastalık durumunda spesifik bağırsak bölgelerindeki değişiklikleri sorgulamak için kullanılabilir. Şekil 4, bir Swiss-roll tekniği ve hematoksilin ve eozin (H &E), Masson'un trikromu ve daha önce tarif edildiği gibi anti-CD3 ve anti-CD68 gibi bağışıklık hücreleri belirteçleri gibi çeşitli leke belirteçleri kullanarak ileum üzerinde immünohistokimya yapabileceğimizi göstermektedir. 12 ve proteinürik farelerin ileumunda biriken apolipoprotein AI (AI) (Şekil 4).
Şekil 1: Protokol tasarımını özetleyen diyagram. Bir insan deneğinden veya geleneksel fareden toplanan dışkı örnekleri, mikropsuz farelere nakli için kullanılır. Kısaltmalar: FMT = fekal mikrobiyota transplantasyonu; BP = kan basıncı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yüksek tuzlu bir diyetteki fareler bağırsak mikrobiyota dysbiosis sergiler. (A) Normal tuz (siyah) ve yüksek tuz (kırmızı) diyetlerinde farelerden elde edilen çekal içeriğindeki tür biyoçeşitliliğinin tahmini. (B) Metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme, normal tuz ve yüksek tuzlu diyet farelerinden gelen bakterilerin ayrı kümeler oluşturduğunu gösterir. (C) Yüksek tuz, artmış Firmicutes/Bacteroidetes oranı ile ilişkilidir. (***p < 0.0001, iki kuyruklu eşlenmemiş Öğrenci t-testleri kullanılarak). Bu rakam Ferguson ve ark.12'den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: NMDS = metrik olmayan çok boyutlu ölçeklendirme; NS = normal tuz; HS = yüksek tuz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yüksek tuzla beslenen farelerden elde edilen FMT, mikropsuz fareleri anjiyotensin II ile indüklenen hipertansiyona yatkınlaştırır. Yüksek tuza bağlı disbiyotik bağırsak mikrobiyotasının aktarılması, normal tuz bağırsak mikrobiyotası alan farelere kıyasla mikropsuz farelerde önemli ölçüde artmış sistolik basınç ile ilişkiliydi. Bu rakam Ferguson ve ark.12'den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: FMT = fekal mikrobiyota transplantasyonu; BP = kan basıncı; Ang II = anjiyotensin II; NS = normal tuz; HS = yüksek tuz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bağırsaktaki hastalık belirteci değişikliklerinin nasıl değerlendirileceğini gösteren immünohistokimya görüntüsü. (A) veya (B) proteinürisi olmayan hiperlipidemi olan farelerden elde edilen ileada apolipoprotein AI boyasını gösteren temsili görüntüler. Büyütme: 200 μm ölçeğinde 5x (A,B, sol); 100 μm ölçeğinde 10x (A,B, sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağırsak mikrobiyotasının kardiyovasküler ve metabolik hastalıklardaki nedensel rolünü incelemek için değerli bir yaklaşım, toplam mikrobiyotayı veya ilgilenilen türleri mikropsuz farelere aktarmaktır. Burada, hipertansif bozukluklarda bağırsak mikrobiyotasının rolünü incelemek için insanlardan dışkı örnekleri toplamak için protokolleri ve geleneksel olarak barındırılan fareleri mikropsuz farelere dönüştürüyoruz.
Farelerde, aerobik bir odada işlenmiş aseptik olarak toplanan çekal içeriklerini kullanırız ve insanlarda dışkı toplarız. FMT, numune hala tazeyken veya sıvı azotta dondurulmuşken hemen yapılabilir ve kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de tutulabilir. Numune hemen dondurulamıyorsa, örneğin numunelerini evde toplayan insanlar gibi, etanol gibi nükleik asitler için bir koruyucu kullanmak önemlidir. Bağırsaktaki bakterilerin çoğu anaeroblardır; Dışkı örneklerini transplantasyon için hazırlarken, bakterilerin aerobik ortamlara maruz kalmasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır, çünkü bu, karışımdaki anaerob miktarının azalması nedeniyle etkinliği azaltabilir27. Uzunlamasına bir çalışma için, toplu etkilerden kaçınmak için numunelerin metagenomik dizilimi birlikte yapılmalıdır. FMT örnekleri, bir araya getirilmiş bir veya daha fazla donörden gelebilir ve daha sonra deney gruplarında birden fazla alıcıya dağıtılabilir.
FMT'nin başarısının, mekanik etkileri keşfetmeden önce deneysel olarak doğrulanması son derece önemlidir. Fekal veya çekal içerikler metagenomik ve donörler ile alıcılar arasındaki benzerlikler değerlendirilerek analiz edilebilir. Beklenen sonuçlar, alfa çeşitlilik indeksleri, ana koordinat analizi ve fonksiyonel profiller yoluyla benzer mikrobiyal çeşitlilik olacaktır. Ancak o zaman bağırsak mikrobiyotasının hastalık etiyolojisinde önemli bir rol oynadığı sonucuna varılabilir. Çalışma, endemik mikrobiyotalarını tüketmek için antibiyotiklerle önceden muamele edilmiş geleneksel olarak barındırılan fareleri kullanıyorsa, bu adım daha da önemlidir. Bunun nedeni, bu adım başarılı olmazsa, hayatta kalan alıcıların bakterilerinin hastalık sonuçlarını etkileyebilmesidir. Bununla birlikte, özellikle klinik öncesi çalışmalarda başarılı FMT, her zaman klinik çeviri ile anlamlı bir şekilde sonuçlanmamaktadır. Bu nedenle, burada açıklanan Swiss-roll tekniğini kullanarak bağırsak morfolojisindeki değişiklikler de dahil olmak üzere, hastalık patofizyolojisinde doğrudan bağırsakla ilgili mekanizmaları dahil etmek için ek doğrulayıcı adımlar gereklidir.
İmmün hücre aktivasyonunun hipertansiyon gelişiminde doğrudan bir rolü vardır, evlat edinen transfer çalışmaları ile gösterilmiştir28,29,30. Mikropsuz fareler, mikrobiyotanın hastalıktaki nedensel rolünü belirlemede altın standart olmasına rağmen, model kardiyometabolik hastalıkların enflamatuar mekanizmalarını incelemede sınırlı olabilir. Mikropsuz fareler, bağırsak mikrobiyotası ve inflamasyon arasındaki etkileşimi incelemede translasyonel ilgilerini azaltan gelişmemiş bir bağışıklık sistemine sahiptir. Alternatif olarak, bu protokol, mikrobiyotalarının antibiyotik kullanılarak tükenmesini veya polietilen glikol31,32 ile bağırsak temizliğini takiben, dışkı örneklerini geleneksel farelere nakletmek için değiştirilebilir. Antibiyotiklerle önceden muamele edilmiş geleneksel olarak barındırılan farelere FMT, mikropsuz fareleri korumak için gereken sıkı kontrollü ve pahalı ortama olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Mevcut kanıtlar, antibiyotik seçiminin, ister bir kombinasyon ister kombinasyon olsun, ve tedavi protokolünün çalışmalar arasında değiştiğini göstermektedir33,34,35. Antibiyotik seçimi, etki mekanizmalarındaki değişiklikler nedeniyle tükenecek bakteri türlerini belirleyecek ve sonuç olarak fenotipi etkileyecektir. Bu nedenle, deneysel tasarım, fenotipe aracılık ettiği bilinen bakteri türlerini dikkate almalı ve geniş spektrumlu antibiyotikler, uygulama şekli ve rejim buna göre seçilmelidir.
Bu protokolün sınırlamaları vardır. Mikropsuz fareler gnotobiyotik tesislerde tutulur, bu da kardiyovasküler hastalıkların incelenmesiyle ilgili deneysel prosedürleri zorlaştırır. Örneğin, radyotelemetri kan basıncını ölçmek için altın standart yöntemdir, ancak çok invaziv cerrahi prosedürler içerir. Bu, bağışık, naif mikropsuz fareler için pratik değildir. Bu nedenle, mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için bu amaçla invaziv olmayan bir kuyruk manşeti kullanılır12. Tipik olarak, kuyruk-manşet pletismografisi kullanılarak nispeten doğru ölçümler elde etmek için, hayvanlar sistolik basınç ölçümlerinden önce eğitilir ve platforma alıştırılır. Mikropsuz FMT çalışmalarında, araştırmacılar çoklu ölçümleri toplamayı ve ortalamasını almayı düşünmelidir36.
Bu zorluklar kan basıncının ötesinde diğer son noktalarda ortaya çıkabilir. Örneğin, kardiyovasküler hastalıkların davranışsal yönlerini araştıran çalışmalar genellikle sık sık kullanım ve dış maruz kalma gerektirir. Maternal obeziteye bağlı bilişsel ve sosyal işlev bozukluğunda yüksek lifli bir diyetin etkilerini araştıran bir çalışma, antibiyotiklerle önceden tedavi edilen geleneksel farelerde başarılı FMT göstermiştir37. Uzunlamasına kardiyovasküler yanıtları araştıran çalışmalar, geleneksel olarak barındırılan farelerde FMT'yi düşünebilir.
Kan basıncını ölçmeye ek olarak, hayvanlar ötenazi yapılabilir ve daha fazla inceleme için dokular toplanabilir. Özellikle, nakledilen mikrobiyotanın başarılı bir şekilde aşılanması için değerlendirilmek üzere çekal içeriği toplanmalıdır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacılara bağırsak mikrobiyomunun mekanizmasını FMT'den doku seviyelerine kadar incelemede rehberlik edecek ve fonksiyonel çalışmalara uygulanabilir. Bu önemlidir, çünkü muazzam miktarda metodolojik ve şu anda mevcut literatür vardır. Mekanik amaçlar için, plazma, bağırsaklar, böbrekler, kalpler ve diğer dokular, ilgili yolları araştırmak için toplanabilir. Bağırsak mikrobiyotasının hastalıktaki nedensel etkileri, ürettikleri metabolitlere ve sızdıran bir bağırsak nedeniyle sisteme salınmalarına bağlıdır. Tüm bağırsağın sağlığı histolojik ve immün boyama yaklaşımlarıyla değerlendirilebilir. Swiss-roll tekniği, farelerde FMT hastalığının etkisini göstermek için kullanılmıştır12,24.
Bağırsak mikrobiyotasının hipertansiyon gibi kardiyovasküler hastalıklara katkısı ilişkisel olmaya devam etmektedir. Burada, dışkı maddesini insan deneklerden veya geleneksel farelerden mikropsuz farelere toplamak, işlemek ve nakletmek için metodolojik yaklaşımlar sunduk. Protokol, bağırsak mikrobiyotasının kardiyometabolik sağlıktaki nedenini ve / veya etkisini tanımlamada araştırılacak ek deneysel uygulamaları ve parametreleri özetlemektedir. İstenilen fenotipin tekrarlanabilirliğini ve titizliğini sağlamak için çalışmalar çoğaltılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar tarafından finansal veya başka türlü hiçbir çıkar çatışması beyan edilmez.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nden Vanderbilt Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülü Hibesi UL1TR002243 (AK'ye) tarafından desteklenmiştir; Amerikan Kalp Derneği Hibe POST903428 (J.A.I.'ye); ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibeleri K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (AK'ye) ve NIH hibe 1P01HL116263 (V.K.'ye). Şekil 1 , Biorender kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
