Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato
Summary
Qui descriviamo l’arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.
Abstract
Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L’arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l’incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all’ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all’aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un’importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.
Introduction
Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule1. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi 2,3. L’isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L’ultracentrifugazione differenziale, considerata il gold standard, è comunemente usata per separare i sEV dai tessuti in cui risiedono normalmente4. Detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici possono essere rimossi con questa tecnica, lasciando solo i sEV.
È stato dimostrato che la collagenasi D e la DNasi I non influenzano le caratteristiche molecolari delle cellule o delle vescicole, con le proprietà di entrambi gli enzimi che contribuiscono al rilascio di vescicole nella matrice extracellulare 5. Questi enzimi sono stati utilizzati per estrarre sEVs dal tessuto melanoma metastatico umano, dal tessuto del cancro del colon e dal tessuto della mucosa del colon 5,6,7. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi D e della DNasi I in questi metodi differiscono, portando a conclusioni incoerenti. Per evitare la coprecipitazione di altri sottotipi di sEV, i ricercatori hanno rimosso vescicole extracellulari più grandi (0,1 μm o 0,2 μm di diametro) mediante filtrazione e/o centrifugazione differenziale8. A seconda del tessuto di origine, possono essere necessari diversi metodi di isolamento e purificazione 9,10.
Utilizzando il tradizionale metodo di ultracentrifugazione differenziale per estrarre i sEV dal tessuto epatico si ottiene uno strato di sostanza bianca sulla superficie del surnatante, senza alcun modo di determinarne le proprietà. In uno studio precedente11, questo strato di sostanza bianca è stato trovato per influenzare la purezza dei sEV. Sebbene il numero di particelle e la concentrazione proteica dei campioni isolati con il metodo tradizionale fossero superiori a quelli del metodo attuale, il coefficiente di variazione era elevato, probabilmente perché molti inquinanti possono portare a una scarsa ripetibilità dei risultati. Cioè, usando il detergente (cioè, rilevando la solubilità delle particelle in 1% Triton X-100), abbiamo scoperto che la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo era maggiore. Quindi, usiamo questo metodo per isolare e purificare i sEV derivati dal tessuto del cancro del colon-retto per la ricerca proteomica.
Attualmente, la ricerca sulle EV nel cancro del fegato si concentra principalmente sul siero, sul plasma e sul surnatante della coltura cellulare12,13,14. Tuttavia, le sEV derivate dal tessuto del cancro del fegato possono riflettere più accuratamente la patologia fisiologica e il microambiente circostante del cancro del fegato ed evitare efficacemente la degradazione e l’inquinamento di altri EV15,16. Con l’uso dell’ultracentrifugazione differenziale, questo metodo può arricchire la resa e ottenere sEV di alta qualità, fornendo una base importante per l’ulteriore studio del cancro del fegato. Questo metodo consente al tessuto del cancro del fegato di essere separato da una netta separazione e di essere dissociato dalla collagenasi D e DNasi I. Quindi, i detriti cellulari, le grandi vescicole e i corpi apoptotici vengono ulteriormente rimossi mediante filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Infine, i sEV vengono isolati e purificati per studi successivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l’analisi a valle, è estremamente importante garantire l’elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il First Affiliated Hospital della Gannan Medical University per aver sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
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