Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado
Summary
Aquí describimos el enriquecimiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado a través de un método optimizado de ultracentrifugación diferencial.
Abstract
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas del tejido pueden reflejar el estado funcional de las células fuente y las características del espacio intersticial del tejido. El enriquecimiento eficiente de estos sEV es un requisito previo importante para el estudio de su función biológica y una clave para el desarrollo de técnicas de detección clínica y tecnología de portadores terapéuticos. Es difícil aislar los sEV del tejido porque generalmente están muy contaminados. Este estudio proporciona un método para el enriquecimiento rápido de sEV de alta calidad a partir de tejido de cáncer de hígado. El método implica un proceso de cuatro pasos: la incubación de enzimas digestivas (colagenasa D y DNasa Ι) con tejido, filtración a través de un filtro celular de 70 μm, ultracentrifugación diferencial y filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Debido a la optimización de la etapa de ultracentrifugación diferencial y la adición de una etapa de filtración, la pureza de los sEV obtenidos por este método es mayor que la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Proporciona una metodología importante y datos de apoyo para el estudio de sEV derivados de tejidos.
Introduction
Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) tienen aproximadamente 30 nm a 150 nm de diámetro y son secretadas por varias células1. Pueden comunicarse con las células de los tejidos y regular el microambiente local o distante mediante el transporte de moléculas biológicas importantes como lípidos, proteínas, ADN y ARN a varios órganos, tejidos, células y partes intracelulares. Por lo tanto, también pueden cambiar el comportamiento de las células receptoras 2,3. El aislamiento y la purificación de sEV específicos es un requisito previo esencial para estudiar su comportamiento biológico durante el desarrollo y el curso de la enfermedad. La ultracentrifugación diferencial, considerada como el estándar de oro, se usa comúnmente para separar los sEV de los tejidos en los que normalmente residen4. Los restos de tejido, los restos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se pueden eliminar mediante esta técnica, dejando solo los sEV.
Se ha demostrado que la colagenasa D y la DNasa I no afectan las características moleculares de las células o vesículas, y las propiedades de ambas enzimas contribuyen a la liberación de vesículas en la matriz extracelular 5. Estas enzimas se han utilizado para extraer sEVs del tejido del melanoma metastásico humano, tejido de cáncer de colon y tejido de la mucosa colónica 5,6,7. Sin embargo, la concentración y el tiempo de digestión de la colagenasa D y la DNasa I en estos métodos difieren, lo que lleva a conclusiones inconsistentes. Para evitar la coprecipitación de otros subtipos de sEVs, los investigadores han eliminado vesículas extracelulares más grandes (0,1 μm o 0,2 μm de diámetro) por filtración y/o centrifugación diferencial8. Dependiendo del tejido fuente, pueden ser necesarios diferentes métodos de aislamiento y purificación 9,10.
El uso del método tradicional de ultracentrifugación diferencial para extraer sEV del tejido hepático da como resultado una capa de materia blanca en la superficie del sobrenadante, sin ninguna forma de determinar sus propiedades. En un estudio previo11, se encontró que esta capa de materia blanca afecta la pureza de los sEV. Aunque el número de partículas y la concentración de proteínas de las muestras aisladas por el método tradicional fueron más altos que los del método actual, el coeficiente de variación fue grande, posiblemente porque muchos contaminantes pueden conducir a una repetibilidad deficiente de los resultados. Es decir, utilizando detergente (es decir, detectando la solubilidad de partículas en Triton X-100 al 1%), encontramos que la pureza de los sEVs obtenidos por este método era mayor. Por lo tanto, utilizamos este método para aislar y purificar sEV derivados del tejido de cáncer colorrectal para la investigación proteómica.
En la actualidad, la investigación sobre sEVs en cáncer de hígado se centra principalmente en suero, plasma y sobrenadante del cultivo celular12,13,14. Sin embargo, los sEV derivados del tejido del cáncer de hígado pueden reflejar con mayor precisión la patología fisiológica y el microambiente circundante del cáncer de hígado y evitar eficazmente la degradación y contaminación de otros EV15,16. Con el uso de la ultracentrifugación diferencial, este método puede enriquecer el rendimiento y obtener sEV de alta calidad, proporcionando una base importante para el estudio posterior del cáncer de hígado. Este método permite que el tejido del cáncer de hígado se separe por separación aguda y se disocie por la colagenasa D y la DNasa I. Luego, los desechos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se eliminan aún más mediante filtración y ultracentrifugación diferencial. Finalmente, los sEV se aíslan y purifican para estudios posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método repetible para extraer sEV del tejido del cáncer de hígado. Los sEV de alta calidad se obtienen mediante aislamiento tisular nítido, tratamiento con enzimas digestivas, ultracentrifugación diferencial y filtración y purificación de membrana filtrante de 0,22 μm. Para el análisis posterior, es extremadamente importante garantizar la alta pureza de los sEV. En el proceso de centrifugación diferencial, aparecerá una capa de sustancias blancas (composición desconocida) en la supe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan por apoyar este trabajo. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
