Метод обогащения небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени
Summary
Здесь мы описываем обогащение небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени, с помощью оптимизированного метода дифференциального ультрацентрифугирования.
Abstract
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV), полученные из ткани, могут отражать функциональное состояние исходных клеток и характеристики интерстициального пространства ткани. Эффективное обогащение этих sEV является важной предпосылкой для изучения их биологической функции и ключом к разработке методов клинического обнаружения и технологии терапевтического носительства. Трудно изолировать sEV от тканей, потому что они обычно сильно загрязнены. Это исследование предоставляет метод быстрого обогащения высококачественных sEV из ткани рака печени. Метод включает в себя четырехступенчатый процесс: инкубацию пищеварительных ферментов (коллагеназы D и ДНКазы Ι) с тканью, фильтрацию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, дифференциальное ультрацентрифугирование и фильтрацию через мембранный фильтр 0,22 мкм. Благодаря оптимизации стадии дифференциального ультрацентрифугирования и добавлению ступени фильтрации чистота электромобилей, полученных этим методом, выше, чем при классическом дифференциальном ультрацентрифугировании. Он предоставляет важную методологию и вспомогательные данные для изучения sEV тканевого происхождения.
Introduction
Малые внеклеточные везикулы (sEV) имеют диаметр от 30 до 150 нм и секретируются различными клетками1. Они могут общаться с тканевыми клетками и регулировать локальное или отдаленное микроокружение, транспортируя важные биологические молекулы, такие как липиды, белки, ДНК и РНК, к различным органам, тканям, клеткам и внутриклеточным частям. Таким образом, они также могут изменять поведение клеток-реципиентов 2,3. Выделение и очистка специфических электромобилей является важной предпосылкой для изучения их биологического поведения во время развития и течения заболевания. Дифференциальное ультрацентрифугирование, считающееся золотым стандартом, обычно используется для отделения sEV от тканей, в которых они обычно находятся4. С помощью этого метода можно удалить тканевый мусор, клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела, оставив только sEV.
Было показано, что коллагеназа D и ДНКаза I не влияют на молекулярные характеристики клеток или везикул, при этом свойства обоих ферментов способствуют высвобождению везикул во внеклеточном матриксе 5. Эти ферменты использовались для извлечения sEV из ткани метастатической меланомы человека, ткани рака толстой кишки и ткани слизистой оболочки толстой кишки 5,6,7. Однако концентрация и время переваривания коллагеназы D и ДНКазы I в этих методах различаются, что приводит к противоречивым выводам. Чтобы избежать соосаждения других подтипов sEV, исследователи удалили более крупные внеклеточные везикулы (0,1 мкм или 0,2 мкм в диаметре) путем фильтрации и/или дифференциального центрифугирования8. В зависимости от исходной ткани могут потребоваться различные методы выделения и очистки 9,10.
Использование традиционного метода дифференциального ультрацентрифугирования для извлечения sEV из ткани печени приводит к образованию слоя белого вещества на поверхности надосадочной жидкости без какого-либо способа определения его свойств. В предыдущем исследовании11 было обнаружено, что этот слой белого вещества влияет на чистоту электромобилей. Хотя количество частиц и концентрация белка в образцах, выделенных традиционным методом, были выше, чем в современных методах, коэффициент вариации был большим, возможно, потому, что многие загрязняющие вещества могут привести к плохой повторяемости результатов. То есть, используя моющее средство (т.е. детектируя растворимость частиц в 1% Triton X-100), мы обнаружили, что чистота sEV, полученных этим методом, была больше. Следовательно, мы используем этот метод для выделения и очистки sEV, полученных из ткани колоректального рака, для протеомных исследований.
В настоящее время исследования sEVs при раке печени сосредоточены в основном на сыворотке, плазме и надосадочной жидкостиклеточной культуры 12,13,14. Тем не менее, sEV, полученные из ткани рака печени, могут более точно отражать физиологическую патологию и окружающее микроокружение рака печени и эффективно избегать деградации и загрязнения других EV15,16. С использованием дифференциального ультрацентрифугирования этот метод позволяет обогатить выход и получить высококачественные sEV, обеспечивая важную основу для дальнейшего изучения рака печени. Этот метод позволяет разделить ткань рака печени путем резкого разделения и диссоциировать коллагеназой D и ДНКазой I. Затем клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела дополнительно удаляются фильтрацией и дифференциальным ультрацентрифугированием. Наконец, sEV выделяют и очищают для последующих исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает воспроизводимый метод извлечения sEV из ткани рака печени. Высококачественные sEV получают путем резкой изоляции тканей, обработки пищеварительными ферментами, дифференциального ультрацентрифугирования, а также фильтрации и очистки фильтрующей мембраны 0,22 мкм….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Первую дочернюю больницу Медицинского университета Ганнань за поддержку этой работы. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
