De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.
Organoïden en sferoïden, driedimensionale groeistructuren in celkweeklaboratoria, worden steeds meer erkend als superieure modellen in vergelijking met tweedimensionale kweekmodellen, omdat ze het menselijk lichaam beter nabootsen en voordelen hebben ten opzichte van dierstudies. Deze studies hebben echter vaak problemen met reproduceerbaarheid en consistentie. Tijdens de lange experimentele processen – met overdrachten van organoïden en sferoïden tussen verschillende celkweekvaten, pipetteren en centrifugeren – worden deze gevoelige en fragiele 3D-groeistructuren vaak beschadigd of verloren. Uiteindelijk worden de resultaten aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. De hier beschreven methoden minimaliseren deze stressvolle stappen en zorgen voor een veilige en consistente omgeving voor organoïden en sferoïden gedurende de hele verwerkingssequentie terwijl ze zich nog in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat bevinden. De onderzoekers kunnen groeien, bevriezen, ontdooien, verwerken, vlekken, labelen en vervolgens de structuur van organoïden of sferoïden onderzoeken onder verschillende hightech-instrumenten, van confocale tot elektronenmicroscopen, met behulp van een enkel multifunctioneel apparaat. Deze technologie verbetert de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en validiteit van de studies, terwijl een stabiele en beschermende omgeving voor de 3D-groeistructuren tijdens de verwerking behouden blijft. Bovendien minimaliseert het elimineren van stressvolle stappen afhandelingsfouten, vermindert het de benodigde tijd en vermindert het het risico op besmetting.
De toekomst van celonderzoek en -therapie ligt binnen 3D-celculturen 1,2,3. Organoïde en sferoïde modellen dichten de kloof tussen in vitro experimenten en diermodellen door betere modellen te maken die de ontwikkeling van het menselijk lichaam, fysiologie en ziekten nabootsen 4,5,6,7,8,9. De reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van deze modellen blijven echter een uitdaging. Bovendien resulteert het hanteren, oogsten, overbrengen en centrifugeren van deze structuren met de huidige technologieën in verlies of beschadiging van de organoïden en sferoïden in veel omstandigheden, wat de resultaten aanzienlijk beïnvloedt.
Ondanks vele protocollen voor histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering en cryopreservatie, is er geen universele benadering met betrekking tot het standaardiseren van experimentele omstandigheden, het hanteren en verwerken van deze delicate structuren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De huidige protocollen zijn ook ongelooflijk lang, afwisselend van enkele dagen tot enkele weken, en omvatten complexe procedures met verschillende reagentia 10,11,12,13,14. Bovendien veroorzaken het oogsten, pipetteren, centrifugen en overbrengen van 3D-groeistructuren tussen celkweekvaten en cryovialen veranderingen in de positionering van de structuren en mechanische krachten en beïnvloeden ze uiteindelijk de differentiatie en rijping van de organoïden en sferoïden. Er is gemeld dat weefseltopologie, positionering van de cellen en mechanische krachten een significante invloed hebben op celdifferentiatie en rijping 6,15,16,17.
Daarom is het wenselijk om de huidige conventionele technologieën te verbeteren om organoïden en sferoïden met stabiele kwaliteit te genereren. Een methode/apparaat dat de hierboven beschreven centrifugatie en andere stappen overslaat en het materiaal van het begin tot het einde van de meerdere processen in één veilige omgeving levert, zou gunstig zijn om de meest consistente en betrouwbare gegevens te bereiken. Bovendien zal dit de tijds-, arbeids- en kostenbeperkingen verminderen.
Het hier beschreven multipurpose device (MD) biedt één veilige omgeving voor meerdere processen van organoïden en sferoïden (aanvullende figuur 1). Dit apparaat en aanvullende protocollen elimineren de stappen voor het oogsten, pipetteren, overbrengen en centrifugeren. De organoïden en sferoïden blijven in hun in vitro omgeving tijdens de sequentiële processen. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit natuurlijke of synthetische extracellulaire matrixcomponenten, zoals in de handel verkrijgbare hydrogels. Met andere woorden, de hier beschreven methoden maken het mogelijk om een monster van organoïden / sferoïden in zijn geheel te verwerken, te onderzoeken en te invriezen terwijl het nog in een hydrogeldruppel zit.
Het biocompatibele apparaat is bestand tegen temperaturen tussen 60 °C en -160 °C, wat het mogelijk maakt om de organoïden/steroïden in een tank met vloeibare stikstof bij -160 °C te herstellen of om harsblokken voor te bereiden voor elektronenmicroscopie bij 60 °C. De niche in het apparaat is ontworpen om een beperkte ruimte voor 3D-groeistructuren te definiëren en de vorming van sferoïden of organoïden te stimuleren op basis van de vorige studies 18,19,20,21,22,23. Dat deel van het apparaat is transparant en bevat een specifieke kunststof die een hoge optische kwaliteit biedt (brekingsindex: 1,43; abbewaarde: 58; dikte: 7,8 mil [0,0078 in of 198 μm]). Zowel de nis als het omringende ‘zijdeel’ veroorzaken autofluorescentie. De transparante nis in het midden heeft een 80 mm2-oppervlak, terwijl het zijgedeelte 600 mm2 is. De diepte van de container is 15 mm en de dikte is 1,5 mm. Deze kenmerken, naast de grootte en het ontwerp van het apparaat, maken het mogelijk om waarnemingen te doen onder verschillende soorten hightech microscoop en de monsters voor te bereiden op elektronenmicroscopisch onderzoek (figuur 2). Het sluitsysteem van het apparaat biedt twee posities, een verzegeld in de vriezer en de andere waardoor gasstroom in de incubator mogelijk is. CCK8-proliferatie- en cytotoxiciteitstests tonen vergelijkbare effecten op cellen in vergelijking met de traditionele celkweekschalen (aanvullende figuur 2). Trypan blue exclusion test toont een hoge levensvatbaarheid van cellen (94%) tijdens de celkweek in de MD (figuur 3).
De processen die kunnen worden uitgevoerd voor één monster in het enkele apparaat omvatten (1) kweken, (2) histologische kleuring, (3) immunostaining, inclusief immunohistochemische en immunofluorescentielabeling, (4) invriezen, (5) ontdooien, (6) onderzoeken onder optische microscopen, zoals brightfield,darkfield, fluorescentie, confocale en superresolutie microscopen, (7) coating en onderzoek rechtstreeks onder een scanning elektronenmicroscoop, of (8) voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie ( Figuur 2).
Er bestaan verschillende methodologieën voor histologische kleuring, immunohistochemische etikettering of fluorescerend labelen van organoïden en sferoïden 10,11,12,13,14,24,25. Het oogsten van hen uit de hydrogel is de eerste en belangrijkste stap van de huidige technologie. Na deze stap maken sommige methoden immuno-labeling met hele mount mogelijk. De geoogste organoïden zijn ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gelabeld voor kleuring en immunostaining in anderen. Het is echter mogelijk dat de secties niet het volledige monster presenteren en slechts beperkte gegevens bevatten met betrekking tot de 3D-architectuur van de structuur. Bovendien zijn schade aan deze 3D-structuren en verlies van antigeniciteit bekende bijwerkingen van deze technologieën.
De aanvullende nieuwe protocollen voor microscopisch onderzoek in dit artikel maken een analyse mogelijk van monsters van de hele montering die nog in een hydrogel zitten. De hier beschreven protocollen omvatten twee nieuw ontwikkelde formuleringen: oplossing voor immunohistochemie (S-IHC) en oplossing voor immunofluorescentie-etikettering (S-IF). De methoden met deze oplossingen stellen onderzoekers in staat om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, omdat er geen schadelijke effecten zijn van traditionele workflows, zoals centrifuging, pipetteren en overbrengen van de delicate structuren. Het hier beschreven protocol elimineert ook de noodzaak voor het oogsten, blokkeren, opruimen en ophalen van antigeen en verkort de hele procedure tot 6-8 uur. Bovendien maakt de methodologie het mogelijk om tegelijkertijd één tot drie antilichamen toe te voegen aan dezelfde S-IF. Daarom is het mogelijk om de resultaten op dezelfde dag te krijgen, zelfs na de meerdere etiketteringsexperimenten, wat een ander voordeel is van het hier beschreven protocol; traditionele immunofluorescentie-etiketteringsprotocollen met hele mount duren meestal tussen de 3 dagen en enkele weken 10,11,12,13,14.
Paraffine-inbedding, een andere schadelijke stap die de antigeniciteit vermindert, wordt ook weggelaten. De 3D-structuur blijft in zijn in vitro omgeving van het begin tot het einde van het microscopisch onderzoek. Omdat de 3D-structuur in zijn groeiomstandigheden blijft, bootsen de eiwitexpressie- en lokalisatiegegevens in vivo omstandigheden beter na. Er worden nauwkeurigere resultaten verwacht, omdat de methodologie de stappen elimineert die de antigeenexpressie van het monster beïnvloeden. Tabel 1 en tabel 2 laten zien hoe deze nieuwe protocollen stappen elimineren, tijd en arbeid in het laboratorium besparen en kosten en afvalproducten verlagen in vergelijking met traditionele workflows.
Naast de cruciale stappen die hierboven zijn beschreven, is een ander probleem het bieden van een cryopreservatiemedium en een methode om de 3D-structuur van het monster te behouden met hogere levensvatbaarheidssnelhedenvan cellen 26,27,28,29,30,31. Cryopreservatie is essentieel voor het creëren van een stabiel modelsysteem en het mogelijk maken van de biobanking van organoïden en sferoïden32,33. Biobanking van de hele originele 3D-structuur zal een meer getrouwe recapitulatie van de natuurlijke gezondheidstoestand of ziekte mogelijk maken. De belangrijkste overwegingen zijn het gemak en de betrouwbaarheid van cryopreservatie en het ontdooien van organoïden / sferoïden. Post-dooi organoïde herstel is zeer laag in de meeste huidige technologieën, vaak minder dan 50%. Recente studies hebben echter veelbelovende resultaten laten zien met verbeterde overlevingskansenvan 26,27,28,29. Lee et al. toonden aan dat 78% van de sferoïde cellen overleefde na cryopreservatie toen ze de oplossing van de Universiteit van Wisconsin gebruikten die 15% DMSO28 bevatte. De celoverlevingsratio steeg tot 83% in de studie van Arai et al.29. De resultaten na cryopreservatie worden echter aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. Bovendien zijn serumvrije reagentia vereist voor goede productiepraktijken in farmaceutische en diagnostische omgevingen. Traditionele workflows gebruiken een medium met foetaal runderserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) voor de langzaam invriezende methode, die beide geassocieerd zijn met handicaps. FBS is een dierlijk product en kan batchvariaties hebben. DMSO is een zeer succesvol cryoprotectant, maar langdurige blootstelling, vooral tijdens het ontdooien, kan cytotoxische effecten veroorzaken30,31.
Dit artikel beschrijft ook de bevriezings-/ontdooimethode van hele organoïden of sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten. In het onderzoek worden twee formules voor het invriezen van organoïden en sferoïden gebruikt: (1) 10% DMSO met traditionele vriesoplossing (FS) en (2) een serum- en DMSO-vrij cryopreservatiemedium. Dit cryopreservatiemedium bevat extracellulaire matrixcomponenten, die verschillen van de huidige formules. De extracellulaire matrix bestaat uit twee hoofdklassen van macromoleculen, proteoglycanen en vezelige eiwitten, die essentieel zijn voor fysieke steigers voor de cellulaire bestanddelen, maar ook processen initiëren die nodig zijn voor weefselmorfogenese, differentiatie en homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Collageen biedt treksterkte, reguleert de celadhesie, ondersteunt chemotaxis en migratie en directe weefselontwikkeling37. Bovendien bieden elastinevezels terugslag naar weefsels die herhaalde rek ondergaan38. Een derde vezelig eiwit, fibronectine, stuurt de organisatie van de interstitiële extracellulaire matrix en heeft een cruciale rol bij het bemiddelen van celaanhechting en functioneert als een extracellulaire mechano-regulator39. Du et al. hebben het cryoprotectieve effect van kippencollageenhydrolysaat op het natuurlijke actomyosinemodelsysteem41 aangetoond. Hun resultaten suggereren dat collageenhydrolysaat de groei van ijskristallen kan remmen, eiwitbevriezing en oxidatie kan verminderen, vergelijkbaar met commerciële cryoprotectanten, en een betere gelstructuur kan bieden na vries-dooicycli. Daarom biedt het toevoegen van extracellulaire matrixcomponenten aan de cryopreservatiemedia een veiligere en beschermende omgeving voor het monster en ondersteunt het de levende structuren om te genezen na bevriezing-ontdooien.
Bovendien beschrijft de huidige studie een eenvoudig protocol om cytoplasmatische membranen en kernen van levende organoïden en sferoïden te labelen terwijl ze zich nog in de hydrogel bevinden.
De MD, als aanvulling op formuleringen en protocollen die hier worden beschreven, vergemakkelijkt snelle en spontane 3D-groei van organoïden en sferoïden in een meer gecontroleerde omgeving en zet het experiment voort in dezelfde omstandigheden. Het monster blijft gedurende het hele proces in dezelfde omgeving en bijna 100% van de 3D-groeiarchitecturen blijven intact in de container. Dit verbetert de homogeniteit tijdens de sequentiële experimenten en maakt een langere kweekperiode mogelijk. Bovendien is het aantal st…
The authors have nothing to disclose.
We zijn Dale Mertes van de Universiteit van Chicago dankbaar voor het opstellen van diagrammen, dr. Mehmet Serif Aydin voor zijn technische ondersteuning aan het Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, en dr. Rana Kazemi van de Maltepe University voor het redigeren van het manuscript.
Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
Microplate reader | Biotek Synergy | ||
Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |