Culture, congélation, traitement et imagerie d’organoïdes et de sphéroïdes entiers alors qu’ils sont encore dans un hydrogel
Summary
La présente étude décrit des méthodologies pour la culture, la congélation, la décongélation, le traitement, la coloration, l’étiquetage et l’examen de sphéroïdes et d’organoïdes entiers sous divers microscopes, alors qu’ils restent intacts dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent.
Abstract
Les organoïdes et les sphéroïdes, structures de croissance tridimensionnelles dans les laboratoires de culture cellulaire, sont de plus en plus reconnus comme des modèles supérieurs par rapport aux modèles de culture bidimensionnels, car ils imitent mieux le corps humain et présentent des avantages par rapport aux études animales. Cependant, ces études rencontrent souvent des problèmes de reproductibilité et de cohérence. Au cours des longs processus expérimentaux – avec les transferts d’organoïdes et de sphéroïdes entre différents vaisseaux de culture cellulaire, le pipetage et la centrifugation – ces structures de croissance 3D sensibles et fragiles sont souvent endommagées ou perdues. En fin de compte, les résultats sont considérablement affectés, car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et la même qualité. Les méthodes décrites ici minimisent ces étapes stressantes et assurent un environnement sûr et cohérent pour les organoïdes et les sphéroïdes tout au long de la séquence de traitement alors qu’ils sont encore dans un hydrogel dans un dispositif polyvalent. Les chercheurs peuvent cultiver, congeler, décongeler, traiter, colorer, étiqueter, puis examiner la structure des organoïdes ou des sphéroïdes sous divers instruments de haute technologie, des microscopes confocaux aux microscopes électroniques, à l’aide d’un seul dispositif polyvalent. Cette technologie améliore la reproductibilité, la fiabilité et la validité des études, tout en maintenant un environnement stable et protecteur pour les structures de culture 3D pendant le traitement. De plus, l’élimination des étapes stressantes minimise les erreurs de manipulation, réduit le temps nécessaire et diminue le risque de contamination.
Introduction
L’avenir de la recherche et de la thérapie cellulaires réside dans les cultures cellulaires 3D 1,2,3. Les modèles organoïdes et sphéroïdes comblent l’écart entre les expériences in vitro et les modèles animaux en créant de meilleurs modèles qui imitent le développement du corps humain, la physiologie et les maladies 4,5,6,7,8,9. Cependant, la reproductibilité et la répétabilité de ces modèles restent difficiles. De plus, la manipulation, la récolte, le transfert et la centrifugation de ces structures avec les technologies actuelles entraînent la perte ou l’endommagement des organoïdes et des sphéroïdes dans de nombreuses conditions, ce qui affecte considérablement les résultats.
Malgré de nombreux protocoles de coloration histologique, de coloration immunohistochimique, de marquage par immunofluorescence et de cryoconservation, il n’existe pas d’approche universelle liée à la normalisation des conditions expérimentales, à la manipulation et au traitement de ces structures délicates sans les perdre ou les endommager. Les protocoles actuels sont également incroyablement longs, alternant de quelques jours à plusieurs semaines, et comprennent des procédures complexes avec divers réactifs 10,11,12,13,14. De plus, la récolte, le pipetage, la centrifugation et le transfert de structures de culture 3D entre les récipients de culture cellulaire et les cryoviales provoquent des changements dans le positionnement des structures et des forces mécaniques, et affectent finalement la différenciation et la maturation des organoïdes et des sphéroïdes. Il a été rapporté que la topologie des tissus, le positionnement des cellules et les forces mécaniques ont un impact significatif sur la différenciation et la maturation cellulaires 6,15,16,17.
Par conséquent, il est souhaitable d’améliorer les technologies conventionnelles actuelles pour générer des organoïdes et des sphéroïdes de qualité stable. Une méthode/un dispositif qui sautera la centrifugation et les autres étapes décrites ci-dessus et fournira le matériau dans un seul environnement sûr du début à la fin des multiples processus serait bénéfique pour obtenir les données les plus cohérentes et les plus fiables. De plus, cela réduira les contraintes de temps, de main-d’œuvre et de coûts.
Le dispositif polyvalent (DM) décrit ici fournit un environnement sûr unique pour de multiples processus d’organoïdes et de sphéroïdes (Figure supplémentaire 1). Ce dispositif et les protocoles complémentaires éliminent les étapes de récolte, de pipetage, de transfert et de centrifugation. Les organoïdes et les sphéroïdes restent dans leur environnement in vitro pendant les processus séquentiels. Cet environnement comprend principalement des composants naturels ou synthétiques de la matrice extracellulaire, comme les hydrogels disponibles dans le commerce. En d’autres termes, les méthodes décrites ici permettent de traiter, d’examiner et de congeler un échantillon entier d’organoïdes / sphéroïdes tout en restant dans une goutte d’hydrogel.
Le dispositif biocompatible résiste à des températures comprises entre 60 °C et -160 °C, ce qui permet de restaurer les organoïdes/stéroïdes dans un réservoir d’azote liquide à -160 °C ou de préparer des blocs de résine pour la microscopie électronique à 60 °C. La niche du dispositif a été conçue pour définir un espace limité pour les structures de croissance 3D et stimuler la formation de sphéroïdes ou d’organoïdes sur la base des études précédentes 18,19,20,21,22,23. Cette partie de l’appareil est transparente et contient un plastique spécifique qui offre une qualité optique élevée (indice de réfraction : 1,43 ; valeur abbe : 58 ; épaisseur : 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). La niche et la partie « latérale » environnante provoquent une autofluorescence. La niche transparente au centre a une surface de 80 mm 2, tandis que la partie latérale est de 600 mm2. La profondeur du conteneur est de 15 mm et l’épaisseur est de 1,5 mm. Ces caractéristiques, outre la taille et la conception de l’appareil, permettent de réaliser des observations sous différents types de microscopes de haute technologie et de préparer les échantillons pour des examens au microscope électronique (Figure 2). Le système de fermeture de l’appareil fournit deux positions, l’une scellée dans le congélateur et l’autre permettant l’écoulement du gaz dans l’incubateur. Les essais de prolifération et de cytotoxicité CCK8 démontrent des effets similaires sur les cellules par rapport aux boîtes de culture cellulaire traditionnelles (figure supplémentaire 2). Le test d’exclusion du bleu de trypan démontre une viabilité cellulaire élevée (94%) lors de la culture cellulaire dans la DM (Figure 3).
Les processus qui peuvent être effectués pour un échantillon dans le dispositif unique comprennent (1) la culture, (2) la coloration histologique, (3) l’immunomarquage, y compris le marquage immunohistochimique et immunofluorescence, (4) la congélation, (5) la décongélation, (6) l’examen au microscope optique, tel que les microscopes à fond clair, à fond noir, à fluorescence, confocaux et à superrésolution, (7) le revêtement et l’examen directement sous un microscope électronique à balayage, ou (8) la préparation à la microscopie électronique à transmission ( Graphique 2).
Différentes méthodologies existent pour la coloration histologique, le marquage immunohistochimique ou le marquage fluorescent des organoïdes et des sphéroïdes 10,11,12,13,14,24,25. Les récolter à partir de l’hydrogel est la première et principale étape de la technologie actuelle. Après cette étape, certaines méthodes permettent l’immuno-marquage à montage entier. Les organoïdes récoltés sont incorporés dans de la paraffine, sectionnés et étiquetés pour la coloration et l’immunomarquage chez les autres. Cependant, les sections peuvent ne pas présenter l’échantillon complet et ne fournir que des données limitées liées à l’architecture 3D de la structure. De plus, les dommages causés à ces structures 3D et la perte d’antigénicité sont des effets secondaires bien connus de ces technologies.
Les nouveaux protocoles complémentaires pour les examens microscopiques de cet article permettent une analyse d’échantillons entiers encore dans un hydrogel. Les protocoles décrits ici comprennent deux formulations nouvellement développées : solution pour immunohistochimie (S-IHC) et solution pour marquage par immunofluorescence (S-IF). Les méthodes avec ces solutions permettent aux chercheurs d’obtenir des données plus précises, car il n’y a pas d’effets néfastes des flux de travail traditionnels, tels que la centrifugation, le pipetage et le transfert des structures délicates. Le protocole décrit ici élimine également le besoin d’étapes de prélèvement, de blocage, de défrichage et de récupération de l’antigène, et raccourcit l’ensemble de la procédure à 6-8 heures. De plus, la méthodologie permet d’ajouter simultanément un à trois anticorps au même S-IF. Par conséquent, il est possible d’obtenir les résultats le même jour même après les multiples expériences d’étiquetage, ce qui est un autre avantage du protocole décrit ici; Les protocoles traditionnels d’étiquetage par immunofluorescence à montage entier prennent généralement entre 3 jours et plusieurs semaines 10,11,12,13,14.
L’incorporation de paraffine, une autre étape néfaste qui réduit l’antigénicité, est également omise. La structure 3D reste dans son environnement in vitro du début à la fin de l’examen microscopique. Étant donné que la structure 3D reste dans ses conditions de croissance, les données d’expression et de localisation des protéines imitent mieux les conditions in vivo . Des résultats plus précis sont attendus, car la méthodologie élimine les étapes affectant l’expression de l’antigène de l’échantillon. Les tableaux 1 et 2 montrent comment ces nouveaux protocoles éliminent les étapes, permettent d’économiser du temps et de la main-d’œuvre en laboratoire et de réduire les coûts et les déchets par rapport aux flux de travail traditionnels.
En plus des étapes cruciales décrites ci-dessus, un autre problème est de fournir un milieu de cryoconservation et une méthode pour préserver la structure 3D de l’échantillon avec des taux de viabilité cellulaire plus élevés 26,27,28,29,30,31. La cryoconservation est essentielle pour créer un système modèle stable et permettre la biobanque d’organoïdes et de sphéroïdes32,33. La biobanque de l’ensemble de la structure 3D originale permettra une récapitulation plus fidèle de l’état naturel de santé ou de maladie. Les considérations clés sont la commodité et la fiabilité de la cryoconservation et la décongélation des organoïdes / sphéroïdes. La récupération des organoïdes post-dégel est très faible dans la plupart des technologies actuelles, souvent inférieure à 50%. Cependant, des études récentes ont montré des résultats prometteurs avec des taux de survie améliorés26,27,28,29. Lee et al. ont démontré que 78% des cellules sphéroïdes ont survécu après la cryoconservation lorsqu’ils ont utilisé la solution de l’Université du Wisconsin contenant 15% de DMSO28. Le rapport de survie cellulaire a augmenté à 83% dans l’étude d’Arai et al.29. Cependant, les résultats après cryoconservation sont considérablement affectés car les structures 3D ne peuvent pas maintenir les mêmes caractéristiques et qualités. En outre, des réactifs sans sérum sont nécessaires pour les bonnes pratiques de fabrication dans les environnements pharmaceutiques et diagnostiques. Les flux de travail traditionnels utilisent un milieu contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la méthode de congélation lente, qui sont tous deux associés à des handicaps. FBS est un produit d’origine animale et peut avoir des variations de lot. Le DMSO est un cryoprotecteur très efficace, mais une exposition à long terme, en particulier lors de la décongélation, peut provoquer des effets cytotoxiques30,31.
Cet article décrit également la méthodologie de congélation / décongélation d’organoïdes entiers ou de sphéroïdes encore dans un hydrogel. Deux formules pour congeler des organoïdes et des sphéroïdes sont utilisées dans l’étude : (1) 10% de DMSO contenant une solution de congélation traditionnelle (FS) et (2) un milieu de cryoconservation sans sérum et DMSO. Ce milieu de cryoconservation contient des composants de matrice extracellulaire, qui sont différents des formules actuelles. La matrice extracellulaire comprend deux classes principales de macromolécules, les protéoglycanes et les protéines fibreuses, qui sont essentielles pour l’échafaudage physique des constituants cellulaires, mais qui initient également les processus nécessaires à la morphogenèse, à la différenciation et à l’homéostasie tissulaires 34,35,36,37,38,39,40 . Les collagènes fournissent une résistance à la traction, régulent l’adhésion cellulaire, soutiennent la chimiotaxie et la migration, et dirigent le développement tissulaire37. De plus, les fibres d’élastine assurent le recul des tissus qui subissent des étirements répétés38. Une troisième protéine fibreuse, la fibronectine, dirige l’organisation de la matrice extracellulaire interstitielle et joue un rôle crucial dans la médiation de la fixation cellulaire et fonctionne comme un mécano-régulateur extracellulaire39. Du et al. ont démontré l’effet cryoprotecteur de l’hydrolysat de collagène de poulet sur le système modèle naturel d’actomyosine41. Leurs résultats suggèrent que l’hydrolysat de collagène peut inhiber la croissance des cristaux de glace, réduire la dénaturation et l’oxydation des protéines de la même manière que les cryoprotecteurs commerciaux et fournir une meilleure structure de gel après les cycles de gel-dégel. Par conséquent, l’ajout de composants de matrice extracellulaire au milieu de cryoconservation fournit un environnement plus sûr et protecteur pour l’échantillon et favorise la guérison des structures vivantes après congélation-décongélation.
De plus, la présente étude décrit un protocole simple pour marquer les membranes cytoplasmiques et les noyaux d’organoïdes et de sphéroïdes vivants alors qu’ils sont encore dans l’hydrogel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le MD, complétant les formulations et les protocoles décrits ici, facilite la croissance 3D rapide et spontanée des organoïdes et des sphéroïdes dans un environnement plus contrôlé et poursuit l’expérience dans les mêmes conditions. Le spécimen reste dans le même environnement pendant tout le processus, et près de 100% des architectures de culture 3D restent intactes dans le conteneur. Cela améliore l’homogénéité pendant les expériences séquentielles et permet une période de culture prolongée. En…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Dale Mertes de l’Université de Chicago pour la préparation des diagrammes, le Dr Mehmet Serif Aydin pour son soutien technique à l’Institut de recherche en sciences et technologies de la santé de l’Université Medipol d’Istanbul, et le Dr Rana Kazemi de l’Université Maltepe pour l’édition du manuscrit.
Materials
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
References
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