Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оценка изменений синаптической пластичности с использованием модели легкой черепно-мозговой травмы в сознании

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

Здесь показано, как модель черепно-мозговой травмы в сознании может быть использована для изучения влияния повторной легкой черепно-мозговой травмы (r-mTBI) на синаптическую пластичность гиппокампа. Модель воспроизводит важные особенности р-мЧМТ у пациентов и используется в сочетании с электрофизиологией in vitro .

Abstract

Легкие черепно-мозговые травмы (mTBI) являются распространенной проблемой здравоохранения в Северной Америке. Существует растущее давление на использование экологически обоснованных моделей ЧМТ с закрытой головкой в доклинических условиях для повышения переводимости в клиническую популяцию. Модель травмы закрытой головы в сознании (ACHI) использует модифицированный контролируемый кортикальный импактор для нанесения травмы закрытой головы, вызывая клинически значимый поведенческий дефицит без необходимости трепанации черепа или использования анестетика.

Этот метод обычно не вызывает смертельных случаев, переломов черепа или кровоизлияний в мозг и больше соответствует легкой травме. Действительно, мягкий характер процедуры ACHI делает ее идеальной для исследований, изучающих повторяющуюся мЧМТ (р-мЧМТ). Растущие данные указывают на то, что r-mTBI может привести к кумулятивной травме, которая вызывает поведенческие симптомы, невропатологические изменения и нейродегенерацию. р-мЧМТ часто встречается у молодых людей, занимающихся спортом, и эти травмы происходят в период устойчивой синаптической реорганизации и миелинизации, что делает молодое население особенно уязвимым к долгосрочному влиянию р-мЧМТ.

Кроме того, р-мЧМТ возникает в случаях насилия со стороны интимного партнера, состояния, для которого существует мало объективных мер скрининга. В этих экспериментах синаптическая функция оценивалась в гиппокампе у молодых крыс, которые испытали r-mTBI с использованием модели ACHI. После травм был использован тканевый слайсер для изготовления срезов гиппокампа для оценки двунаправленной синаптической пластичности в гиппокампе через 1 или 7 дней после р-мЧМТ. В целом, модель ACHI предоставляет исследователям экологически обоснованную модель для изучения изменений синаптической пластичности после mTBI и r-mTBI.

Introduction

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является серьезной проблемой для здоровья, с ~ 2 миллионами случаев в Канаде и Соединенных Штатах каждый год 1,2. ЧМТ поражает все возрастные группы и полы и имеет уровень заболеваемости выше, чем любое другое заболевание, особенно включая рак молочной железы, СПИД, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз3. Несмотря на распространенность ЧМТ, ее патофизиология остается малоизученной, а варианты лечения ограничены. Отчасти это связано с тем, что 85% всех ЧМТ классифицируются как легкие (мЧМТ), а ранее считалось, что ЧМТ вызывает только ограниченные и преходящие поведенческие изменения без долгосрочных психоневрологических последствий 4,5. В настоящее время признано, что восстановление после мЧМТ может занять от нескольких недель до 5,6 лет, ускорить более серьезные неврологические заболевания4 и что даже повторяющиеся «субконтузионные» удары влияют на мозг7. Это вызывает тревогу, поскольку спортсмены в таких видах спорта, как хоккей/футбол, имеют >10 субконтузионных ударов головы за игру/тренировку 7,8,9,10.

Подростки имеют самую высокую заболеваемость мЧМТ, а в Канаде примерно один из 10 подростков ежегодно обращается за медицинской помощью в связи со спортивным сотрясением мозга11,12. На самом деле, любой субконтузионный удар головы или мЧМТ может вызвать диффузное повреждение головного мозга, и это также может создать более уязвимое состояние для последующих травм и / или более серьезных неврологических состояний 13,14,15,16,17. В Канаде закон Роуэна юридически признает, что предшествующая травма может повысить уязвимость мозга к дальнейшему повреждению18, но механистическое понимание р-мЧМТ остается крайне неадекватным. Однако ясно, что одиночная и р-мЧМТ может влиять на способность к обучению в течение19,20 школьных лет, иметь специфические для пола результаты 21,22,23,2 4 и ухудшать когнитивные способности в более позднем возрасте16,25,26. Действительно, когортный анализ сильно связывает р-мЧМТ в раннем возрасте с деменцией на более позднем этапе27,28. р-мЧМТ также потенциально связана с хронической травматической энцефалопатией (ХТЭ), которая характеризуется накоплением гиперфосфорилированного тау-белка и прогрессирующей атрофией коры головного мозга и провоцируется значительным воспалением 27,29,30,31. Хотя связи между р-мЧМТ и ХТЭ в настоящее время являются спорными32, эта модель позволит более подробно изучить их в доклинических условиях.

ЧМТ часто описывается как «невидимая травма», поскольку она возникает в закрытом черепе и ее трудно обнаружить даже с помощью современных методов визуализации33,34. Точная экспериментальная модель мЧМТ должна придерживаться двух принципов. Во-первых, он должен повторить биомеханические силы, обычно наблюдаемые в клинической популяции35. Во-вторых, модель должна индуцировать гетерогенные поведенческие результаты, что также широко распространено в клинических популяциях36,37,38. В настоящее время большинство доклинических моделей, как правило, являются более серьезными, включая трепанацию черепа, стереотаксическое подголовье, анестезию и контролируемые корковые воздействия (CCI), которые приводят к значительным структурным повреждениям и более обширным поведенческим дефицитам, чем обычно наблюдается клинически33. Еще одна проблема, связанная со многими доклиническими моделями сотрясения мозга, которые включают краниотомию, заключается в том, что эта процедура сама по себе создает воспаление в головном мозге, и это может усугубить симптомы mTBI и невропатологию от любой последующей травмы39,40. Анестезия также приводит к нескольким сложным смешениям, включая уменьшение воспаления 41,42,43, модуляцию функциимикроглии 44, высвобождениеглутамата 45, проникновение Ca2+ через NMDA-рецепторы46, внутричерепное давление и церебральный метаболизм 47. Анестезия также приводит к путанице, увеличивая проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), гиперфосфорилирование тау и уровни кортикостероидов, одновременно снижая когнитивные функции 48,49,50,51. Кроме того, диффузные травмы с закрытой головой составляют подавляющее большинство клинических ЧМТ52. Они также позволяют лучше изучить множество факторов, которые могут влиять на поведенческие результаты, включая пол21, возраст 53 года, интервал между травмами15, тяжесть54 и количество травм23.

Направление ускоряющих/замедляющих сил (вертикальное или горизонтальное) также является важным фактором для поведенческих и молекулярных результатов. В исследованиях, проведенных Михасюком и его коллегами, сравнивались две модели диффузной закрытой ЧМТ: падение веса (вертикальные силы) и боковое воздействие (горизонтальные силы)55. Как поведенческий, так и молекулярный анализы выявили гетерогенные модельные и половые зависимости от исходов после мЧМТ. Таким образом, модели животных, которые помогают избежать хирургических процедур, включая линейные и вращательные силы, более репрезентативны для физиологических условий, при которых обычно возникают эти травмы33,56. Модель ACHI была создана в ответ на эту потребность, позволяя быстро и воспроизводимо индукцию мЧМТ у крыс, избегая при этом процедур (т.е. анестезии), которые, как известно, искажают половые различия57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Одобрение всех процедур с животными было предоставлено Комитетом по уходу за животными Университета Виктории в соответствии со стандартами Канадского совета по уходу за животными (CCAC). Все самцы крыс породы Лонг-Эванс были выведены на дому или куплены (см. Таблицу материалов).

1. Условия содержания и разведения

  1. Дайте животным акклиматизироваться к условиям содержания в течение 1 недели перед отъемом на 21-й послеродовой день (PND).
  2. Содержание крыс в стандартных клетках при температуре 22,5 °C ± 2,5 °C с свободным доступом к пище и воде в течение 12 часов в режиме свет/темнота.
  3. Группируйте и размещайте животных с двумя или тремя однопометниками соответствующего пола и случайным образом распределяйте их либо по фиктивным условиям, либо по условиям r-mTBI.
  4. Выполняйте все процедуры с 7:30 до 23:30.

2. Постановка процедуры при закрытой черепно-мозговой травме в сознании

  1. Позиция 2.75 дюйма. пенопластовая прокладка низкой плотности (100 см x 15 см x 7 см) под ударным элементом, обеспечивающая вращение головки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поролоновая прокладка имела постоянную пружины ~ 2,500 Н/м, но может варьироваться от 3,100 до 5,600 Н/м58. Уровень упругости (низкий, средний и высокий) не является предиктором исхода травмы59. Поролоновая прокладка является нерасходуемым материалом. Обычно его заменяют ежегодно или в случае загрязнения или повреждения.
  2. Включите модифицированное кортикальное ударное устройство (рис. 1A) и установите скорость 6 м/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти спецификации предназначены для выявления острых неврологических нарушений у крыс ювенильного и подросткового возраста, которые аналогичны признакам mTBI, но такие параметры могут не подходить для пожилых животных или других видов (например, мышей или хорьков). Обзор общих параметров ACHI см.в разделе 60.

3. Индукция мЧМТ

  1. Когда крысы достигнут PND 24, переместите их в процедурный кабинет, где будут проводиться процедуры. Убедитесь, что эта комната отделена от их обычной жилой среды.
  2. Аккуратно поместите крысу в удерживающий конус, убедившись, что морда и ноздри находятся близко к небольшому отверстию конуса, чтобы обеспечить достаточную вентиляцию. Используйте пластиковую заколку для волос, чтобы удерживать конус закрытым на каудальном конце, чтобы предотвратить движение, когда крыса помещена в удерживающий конус.
    1. Используйте оценки удерживающих устройств, чтобы зафиксировать соблюдение или переносимость животными удерживающего конуса и процедуры ACHI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка сдержанности может быть использована в качестве оценки стресса у животных. Таким образом, критерии исключения могут быть разработаны с использованием оценки сдержанности для уменьшения вариабельности между субъектами, возникающей из-за чрезмерной реакции на стресс.
      1. Дайте оценку от 0 до 4 в зависимости от готовности животного войти в конус, его движений и вокализаций. Дайте оценку 0, если нет сопротивления удерживанию, в то время как оценка 1 соответствует тому, что животное поворачивается в 1-2 раза и практически не издает вокализацию или извивается. Поставьте оценку 2, если животное повернулось в 2-3 раза и демонстрирует некоторую вокализацию или извивание. Дайте 3 балла за сдержанность, если животное повернулось в 5-10 раз и демонстрирует больше вокализаций и извиваний. Наконец, поставьте оценку 4, если животное повернулось более чем в 10 раз с частыми вокализациями и извиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация также указана в самом оценочном листе (Дополнительная таблица S1 и Дополнительная таблица S2).
  3. Пока крыса удерживается, вручную расположите шлем (рис. 1B) над средней линией, а целевой диск — над левой теменной долей (рис. 1C, D).
  4. Поместите крысу на поролоновую подушку и вручную установите ударный элемент в положение «Выдвиньте». Вручную опустите наконечник ударного элемента так, чтобы он соприкасался с прицельным диском на шлеме. Вручную установите ударный элемент в положение «Втягивание», чтобы ударный элемент был поднят на 10 мм над шлемом.
  5. С помощью циферблата на стереотаксическом кронштейне опустите ударный наконечник на 10 мм, чтобы он снова коснулся прицельного диска на шлеме. Поверните переключатель удара, чтобы голова животного быстро разогналась на 10 мм со скоростью 6 м/с.
  6. После того, как устройство будет активировано, немедленно извлеките животное из удерживающего конуса и приступайте к немедленному протоколу неврологической оценки (NAP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущих экспериментов этот протокол повторялся в общей сложности восемь раз с интервалом в 2 часа.

4. Индукция фиктивной травмы

  1. Следуйте всем экспериментальным процедурам, как описано выше в разделе 3, но поместите крысу рядом с траекторией ударного поршня, чтобы не получить травму.

5. Протокол неврологического обследования

ПРИМЕЧАНИЕ: NAP можно использовать для измерения уровня сознания, а также когнитивного и сенсомоторного функционирования.

  1. На исходном уровне и сразу после индукции мЧМТ или фиктивной травмы оцените крыс с помощью NAP, как описано в56,61. На столе поставьте домашнюю клетку крыс и клетку для восстановления, расположенные на расстоянии 100 см друг от друга. Равномерно отцентрируйте бревно поверх обеих клеток. Кроме того, подложите под балансир сложенное полотенце или дополнительную амортизацию.
  2. При необходимости оцените уровень сознания. Если животные не реагируют после mTBI, оцените апноэ (остановку дыхания) и любую задержку рефлекса выпрямления с помощью секундомера, чтобы записать время, необходимое животному, чтобы возобновить дыхание и / или выпрямиться из положения лежа на спине в положение лежа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потеря рефлекса выпрямления и апноэ редко встречаются при модели ACHI, но иногда они могут наблюдаться у молодых животных.
  3. Оцените когнитивную и сенсомоторную функцию крысы, используя следующую последовательность тестов. Проводите эти тесты быстро последовательно после оценки сознания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суммирование этих четырех тестов дает общий балл из 12, если нет наблюдаемого поведенческого дефицита. Дефицит умаляет эту оценку.
    1. Реакция испуга
      1. Поместите крысу в пустую клетку для восстановления и громко хлопните (50 см) по клетке. Запишите реакцию животного на шум, используя следующую систему подсчета очков:
        3 = быстрая реакция испуга на звук (например, движение уха/подергивание, прыжок, замирание всего тела).
        2 = Медленная реакция или легкая замерзающая реакция на звук.
        1 = Наблюдаются только движения уха.
        0 = отсутствие реакции на звук.
    2. Разгибание конечностей
      1. Разместив балку (100 см в длину, 2 см в ширину и 0,75 см в толщину), расположенную горизонтально поперек дома крысы и клеток для восстановления, возьмите крысу за основание хвоста и поднесите ее к балке. Убедитесь, что крыса находится достаточно близко, чтобы ее можно было легко схватить. Оцените способность крысы вытягивать обе конечности к лучу с помощью следующей системы оценки:
        3 = Полное разгибание обеих передних конечностей и захват балки.
        2 = Вытянута только одна конечность.
        1 = Прерывистое разгибание или втягивание передних конечностей.
        0 = передние конечности вялые / не разгибаются.
    3. Лучевая прогулка
      1. Поместите животное в центр горизонтальной балки на отметке 50 см напротив его домашней клетки. Убедитесь, что луч находится на равном расстоянии между домашней клеткой крысы и клеткой для восстановления (расположены на расстоянии ~ 80 см друг от друга). Позвольте крысе пройти по балке. Оцените способность крысы балансировать и ходить с помощью следующей системы оценки:
        3 = Успешно проходит по балке с проскальзыванием менее двух футов в течение 10 с.
        2 = Успешно проходит по балке, но наблюдается более двух скольжений ногами.
        1 = Нелокомотивное движение, «плавательное» движение.
        0 = Не может ходить по балке или не может двигаться в течение 10 с.
    4. Вращающаяся балка
      1. Переместите крысу в центр луча, убедившись, что крыса сбалансирована. Поднимите балку на 80 см над полотенцем или мягкой поверхностью и начните вручную вращать балку со скоростью один оборот в секунду в течение 4 с (всего четыре оборота). Оцените способность крысы оставаться на луче во время его вращения с помощью следующей системы подсчета очков:
        3 = Крыса остается на луче в течение всех четырех вращений.
        2 = Крыса выпадает на четвертом обороте.
        1 = Крыса выпадает на втором или третьем обороте.
        0 = Крыса падает во время первого вращения.
  4. По завершении дневного сна верните mTBI и фиктивных крыс в их домашние клетки. Повторите по мере необходимости для процедур r-mTBI. Следите за самочувствием животных после травм с помощью контрольного списка мониторинга в клетке (дополнительный файл 1). Если есть какие-либо признаки отклонения от нормы (любой балл, который не равен N) во время мониторинга со стороны клетки, следует провести полную оценку боли с помощью шкалы боли и контрольного списка расширенного мониторинга после удара головой (дополнительный файл 2).

6. Подготовка ломтика

ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании синаптическая пластичность оценивалась у животных после р-мЧМТ через 1 или 7 дней после мЧМТ. В эти дни животных индивидуально привозили в лабораторию в крытых клетках перед жертвоприношением.

  1. Охладите (-20 °C) на ночь все хирургические инструменты (рис. 2A), необходимые для изготовления срезов гиппокампа: стандартные ножницы, рассекающие ножницы, щипцы, ронгеры, шпатели и охлаждающий блок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевый клей и инкубационная камера не должны храниться в холодильнике.
  2. Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую 125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaHPO 4, 25 мМ NaHCO 3, 2 мМ CaCl2,1,3 мМMgCl2 и 10 мМ декстрозы (300 ± 10 мОсм; рН 7,2-7,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основной раствор aCSF должен непрерывно пузыриться с карбогеном (95% O 2/5% CO2) в течение всего срока действия протокола.
  3. Перед эвтаназией животного (этап 6.8) приготовьте 12,5 мл агарозы. Растворите 0,25 г агарозы в 12,5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS) в микроволновой печи в конической пробирке объемом 50 мл с шагом 10 с.
  4. Держите агарозу в тепле (42 °C) и встряхните на нагревательной пластине, чтобы предотвратить ее затвердевание.
  5. Установите режущую станцию на льду, включающую чашку Петри и небольшой стакан (50 мл), наполненный ледяным aCSF (4 °C), и опрокинутую чашку Петри с куском смачиваемой фильтровальной бумаги сверху (рис. 2A). Непрерывно пузырите aCSF в маленьком стакане с карбогеном.
  6. Нагрейте водяную баню до 32 °C. Заполните камеру восстановления aCSF и непрерывно пузыритесь с карбогеном (рис. 2B).
  7. Транспортировка животного в экспериментальную комнату.
  8. Обезболивают животное, используя 5% изофлуран в качестве ингалянта (до отсутствия рефлекса отмены), а затем быстро обезглавливают его с помощью небольшой гильотины.
  9. Препарируйте мозг из черепа в чашке Петри, наполненной ледяной (4 ° C) aCSF, удерживая череп погруженным в aCSF, чтобы помочь быстро охладить ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура обычно занимает менее 5 минут, но скорость удаления мозга не является критическим фактором, если мозг погружен в охлажденную спинномозговую жидкость.
  10. Поместите мозг в маленький стакан охлажденного и карбогенированного ликвора для дальнейшей очистки и охлаждения образца.
  11. Переместите мозг в перевернутую чашку Петри и поместите его на фильтровальную бумагу. Используйте острый скальпель, чтобы удалить мозжечок и префронтальную кору, чтобы «заблокировать» мозг. Разделите два полушария, сделав разрез по средней линии мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол выполняется по одному полушарию за раз. Крайне важно, чтобы полушарие, которое в настоящее время не подготавливается, оставалось погруженным в стакан ледяного (4 °C) карбогенированного aCSF.
  12. Чтобы создать поперечные срезы гиппокампа, поместите полушарие на медиальную поверхность. Наклоните лезвие скальпеля под углом ~ 30 ° внутрь и удалите тонкий срез с дорсальной поверхности мозга, чтобы обеспечить плоскую поверхность для мозга, который будет установлен на поршне, используемом слайсером. Переверните мозг на дорсальную поверхность и аккуратно промокните ткань на сухой фильтровальной бумаге, чтобы удалить излишки aCSF. Используя цианоакрилатный клей, прикрепите дорсальную поверхность мозга к поршню, оставив вентральную поверхность в вертикальном положении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы клей не стекал по краю поршня, так как это приведет к его прилипанию к металлической трубке, используемой для хранения агарозы, и предотвратит движение поршня.
  13. Протяните внешнюю трубку поршня над мозгом и налейте жидкость агарозы в трубку до тех пор, пока мозг полностью не покроется. Быстро затвердейте агарозу, зажав охлаждающий блок над трубкой поршня (рис. 2А).
  14. Поместите поршень в камеру слайсера и закрепите камеру винтом. Закрепите лезвие и добавьте в камеру слайсера ледяной, насыщенный кислородом aCSF.
  15. На слайсере (рис. 2B) установите скорость резки на 4, колебания на 6 и переключите переключатель непрерывной/одиночной нарезки в положение непрерывной. Толчок начинают, чтобы начать рассечение мозга на 400 мкм.
  16. Когда слайсер разрезает мозг, используйте пипетку Пастера большого диаметра, чтобы перенести каждый ломтик в ванну для восстановления насыщенного кислородом aCSF по мере его секционирования (рис. 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: По мере того, как каждый ломтик разрезается, его можно последовательно помещать в разные лунки восстановительной ванны. Этот протокол обычно дает от шести до восьми срезов, содержащих гиппокамп для каждого полушария. Атлас крыс 62 может быть использован для определения дорсально-вентрального положения отдельных срезов в мозгекрысы .
  17. Дайте ломтикам восстановиться при 32 ° C в течение 30 минут, а затем оставьте для восстановления еще на 30 минут при комнатной температуре (23 ° C).
  18. Повторите эти шаги, чтобы создать срезы из второго полушария.

7. Электрофизиология поля

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить записи внеклеточного поля зубчатой извилины (DG), выполните следующие шаги. После 60-минутного восстановления отдельные срезы гиппокампа готовы к записи внеклеточного поля.

  1. Используя имеющийся в продаже съемник микропипеток, вытяните записывающие электроды (1-2 МОм) из 10-сантиметровых боросиликатных стеклянных капилляров с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 1,1 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Записывающий электрод должен иметь сопротивление ~1 МОм, а наконечники должны иметь размер ~1 мм. Постоянство параметров электродов важно для хорошей записи.
  2. Включите компьютер и оборудование, которое будет использоваться для записи: усилитель, дигитайзер, стимулятор, микроманипулятор, регулятор температуры, свет микроскопа и вакуумный насос.
  3. Наполните стакан спинномозговой жидкостью и подключите ее к системе перфузии с контролем силы тяжести. Откройте клапан aCSF на перфузионной системе, чтобы начать поток aCSF через камеру перфузии. Поддерживайте скорость потока примерно одну или две капельницы / с или 2 мл / мин. Непрерывно карбогенат aCSF в течение всего времени электрофизиологических записей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно поддерживать постоянную скорость капельного выделения карбогенированного aCSF во время полевых записей. Также крайне важно, чтобы электрод сравнения был полностью погружен в aCSF.
  4. Используйте пипетку Пастера для переноса среза гиппокампа из восстановительной ванны в перфузионную камеру, которая непрерывно перфузируется карбогенированным aCSF и поддерживается при температуре 30 ± 0,5 ° C. Сориентируйте срез мозга так, чтобы в поле зрения были видны зубчатая извилина и слой гранулярных клеток. Стабилизируйте срез с помощью изогнутых проволочных грузиков. Запустите компьютерное программное обеспечение для сбора данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе может быть полезно выключить вакуумный насос, чтобы можно было свободно манипулировать тканью. Делать это нужно быстро, так как слишком много манипуляций может повредить ткани. Кроме того, перфузионная камера может переполниться спинномозговой жидкостью, если это займет слишком много времени. Как только ткань правильно сориентируется и стабилизируется, включите вакуумный насос.
  5. Используйте вертикальный микроскоп для визуализации ДГ с косой оптикой. Расположите концентрический биполярный стимулирующий электрод для активации волокон медиального перфорантного пути (MPP) в средней трети молекулярного слоя. Затем поместите стеклянную микропипетку, заполненную aCSF, в MPP (рис. 3A, B). Начните с электродов, расположенных дальше друг от друга (т. е. стимулирующего электрода рядом с CA3, а записывающего электрода чуть выше гену DG), так как прикосновение к ткани приведет к повреждению волокон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально, чтобы все записи имели электроды, расположенные на равном расстоянии от слоя клетки, на расстоянии примерно 200 мкм друг от друга.
  6. После того, как стимулирующие и записывающие электроды расположены, визуализируйте вызванные реакции поля с помощью усилителя, дигитайзера и записывающего программного обеспечения.
  7. Чтобы найти подходящее поле возбуждающего постсинаптического потенциала (fEPSP), стимулируйте ткань импульсами тока 0,12 мс с частотой 0,2 Гц (каждые 5 с), когда пользователь умеет находить ответы, или с частотой 0,067 Гц (каждые 15 с) для менее опытных пользователей, чтобы избежать чрезмерной стимуляции. Убедитесь, что fEPSP имеет минимальную амплитуду 0.7 мВ с прозрачным волоконным залпом, меньшим, чем fEPSP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно расположить оба электрода на равном расстоянии от слоя ячейки, чтобы получить максимальную реакцию поля, и достаточно далеко друг от друга (т.е. ~ 200 мкм), чтобы создать небольшой залп волокна. Небольшие корректировки положения электродов могут помочь увеличить амплитуду ответа, хотя они должны быть сведены к минимуму, чтобы избежать повреждения тканей.
  8. Определите максимальную амплитуду fEPSP, увеличив интенсивность стимуляции, а затем установите имитирующую интенсивность так, чтобы fEPSP составляла 70% от максимальной амплитуды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная амплитуда установлена на 70% для исследований долгосрочной депрессии (LTD) и на 50% для исследований долгосрочного потенцирования (LTP). Максимальная амплитуда определяется путем регулировки силы стимуляции до тех пор, пока fEPSP не перестанет увеличиваться в амплитуде. Для fEPSP с максимальной амплитудой 2 мВ размер отклика будет скорректирован до 1,4 мВ для исследований LTD и 1,0 мВ для исследований LTP, чтобы дать возможность fEPSP угнетать или потенцировать (соответственно).
  9. Установите стабильный базовый уровень предварительного кондиционирования в течение 20 минут с импульсами 0,12 мс с частотой 0,067 Гц. Для того, чтобы срезы считались стабильными, обратите внимание на <10% изменчивость начального наклона fEPSP, а наклон линии, наиболее подходящей для наилучшего соответствия через нанесенные на график наклоны fEPSP, должен составлять <0,5. Перейдите к следующим шагам записи, когда EPSP будут проверены на стабильность в течение 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные антагонисты рецепторов могут быть добавлены к aCSF для блокирования или усиления LTD и LTP. Если они необходимы, убедитесь, что срезы подвергаются воздействию этих фармакологических агентов в течение этого исходного периода и что требования к стабильным записям соблюдены. Примеры см.63,64,65.
  10. Во-первых, определите изменения основных синаптических свойств с помощью парных импульсных стимулов и построения кривых ввода-вывода стимул-реакция. Для парного импульсного теста применяют серию парных импульсов с межимпульсным интервалом 50 мс при частоте 0,033 Гц. Для кривых ввода-вывода примените ряд (10) возрастающих интенсивностей стимулов (0,0-0,24 мс) с частотой 0,033 Гц, чтобы построить график изменения размера отклика fEPSP.
  11. Для изучения LTD, который в первую очередь зависит от активации рецепторов CB164,66, используйте протокол 10 Гц (6 000 импульсов при 10 Гц). Этот протокол занимает 10 минут.
  12. Для записи после кондиционирования возобновите использование одноимпульсной стимуляции (0,12 мс при частоте 0,067 Гц) в течение дополнительных 60 минут.
  13. После записи после кондиционирования снова введите парные импульсные стимулы, а затем кривую ввода-вывода. Сравните их с базовыми записями, чтобы наблюдать изменения в свойствах пресинаптического высвобождения и помочь оценить состояние среза для долгосрочных записей.
  14. Во время анализа будьте консервативны и придерживайтесь критериев исключения при определении того, следует ли сохранять данные из отдельных срезов в наборе данных синаптической пластичности. Исключите срезы, которые демонстрируют большой наклон в линии наилучшего соответствия наклонов fEPSP во время базовой линии предварительного кондиционирования (уклон >0,5), нестабильность базовой линии предварительного кондиционирования (изменение >на 10%) и/или нестабильность в период после кондиционирования (наклон >1,5 за 50-60 минут после кондиционирования).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Модель черепно-мозговой травмы в сознании является жизнеспособным методом индуцирования r-mTBI у молодых крыс. Крысы, подвергшиеся воздействию r-mTBI с моделью ACHI, не показали явного поведенческого дефицита. Испытуемые в этих экспериментах не проявляли латентности справа или апноэ в какой-либо момент во время процедуры r-mTBI, что указывает на то, что это действительно была мягкая процедура TBI. Тонкие поведенческие различия действительно проявились в НПД; Как описано выше, крысы были оценены по четырем сенсомоторным задачам (реакция испуга, разгибание конечностей, ходьба луча и вращение луча) по шкале от 0 до 3, где 3 не представляли никаких нарушений с задачей. Таким образом, чем ниже показатель NAP, тем сильнее было нарушено животное. В начале исследования не было различий в показателях NAP между фиктивными крысами и крысами r-mTBI. После всех сеансов ACHI крысы r-mTBI показали значительные нарушения в задачах NAP по сравнению с фиктивными (рис. 4). Однако, как сообщалось ранее для воздействий, нанесенных в течение нескольких дней (т.е. 2 или 4 дней), последующее добавление травм в течение дня не усугубляло и не вызывало дополнительного поведенческого дефицита. Таким образом, модель ACHI r-mTBI вызывает тонкие, но значительные поведенческие дефициты в эти острые моменты после травмы.

В соответствии с протоколом травмы вызванные полевые реакции и синаптическая пластичность были исследованы во входе MPP в DG гиппокампа на 1-й день после травмы (PID1) и PID7. Здоровье среза исследовали с использованием fEPSP в ответ на возрастающую серию ширин импульсов в каждом срезе. Как показано на рисунке 3C, не было никакой разницы в кривых ввода-вывода, генерируемых в срезах, полученных от фиктивных крыс и крыс r-mTBI. Для исследования высвобождения пресинаптического трансмиттера вводили серию парных импульсов (межимпульсный интервал 50 мс) и рассчитывали отношение величины второго фЭПСП относительно первого фЭПСП. Соотношение парных импульсов не различалось между фиктивными крысами и крысами r-mTBI (рис. 3D). Таким образом, эти данные указывают на то, что r-mTBI не изменял основную синаптическую физиологию во входе MPP в DG. Для исследования LTD был введен протокол LTD с частотой 10 Гц, чтобы индуцировать LTD, зависящую от эндоканнабиноидов64. На PID1 наблюдалось значительное снижение пропускной способности входных данных MPP в ГД для поддержания LTD (рис. 3E). Однако это снижение LTD было временным, и по PID7 срезы от фиктивных животных и животных с r-mTBI показали эквивалент LTD (рис. 3F), хотя было указание на небольшую тенденцию к тому, что срезы животных r-mTBI демонстрируют увеличение LTD.

Figure 1
Рисунок 1: Установка процедуры ACHI, используемая для моделирования r-mTBI . (A) Модифицированный контролируемый кортикальный ударник использовался для быстрого смещения головы животного на 10 мм со скоростью 6,0 м/с. (B, C) Изготовленный на 3D-принтере шлем с мишенью левой теменной коры. (D) Испытуемые были помещены в пластиковый удерживающий мешок на пенопластовой платформе, при этом шлем был помещен вокруг удерживающего конуса и расположен таким образом, чтобы целевое место находилось непосредственно под наконечником ударного элемента. Сокращения: ACHI = закрытая черепно-мозговая травма в сознании; r-mTBI = повторная легкая черепно-мозговая травма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Материалы и настройка, необходимые для подготовки среза. (A) Инструменты, используемые для извлечения, монтажа, нарезки и инкубации мозга: а) культуральная чашка с фильтровальной бумагой; (b) различные инструменты для вскрытия, включая стандартные ножницы, рассекающие ножницы, щипцы, ронжер и шпатели; c) тканевый клей; d) компресстомный поршень и трубка для образца; е) перьевое лезвие и держатель лезвия; f) холодильный блок; g) Срезовая инкубационная камера. (B) Компресстомный тканевый слайсер. (C) Срезы, инкубируемые в ванне, содержащей искусственную спинномозговую жидкость, которая непрерывно насыщается кислородом 95% O 2/5% CO2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Острые нарушения синаптической пластичности у молодых самцов крыс из-за r-mTBI с использованием модели ACHI . (A) Основные пути гиппокампа. Медиальный перфорантный путь состоит из входа из энторинальной коры в зубчатую извилину (синий). Медиальный перфорантный путь вводит синапс на гранулярные клетки зубчатой извилины (фиолетовый). (B) Микрофотография среза мозга гиппокампа в светлом поле (4-кратное увеличение), показывающая фактическое размещение биполярного стимулирующего электрода (слева) и пипетки со стеклянным записывающим электродом (справа) в медиальной проводящей траектории зубчатой извилины. (C) График ввода-вывода (наклон fEPSP) для различных интенсивностей моделирования (10-300 мкс) на PID1 и PID7 для фиктивных крыс и крыс с r-mTBI. (D) Коэффициенты парных импульсов для крыс с фиктивной и r-mTBI (межимпульсный интервал 50 мс). (E) Временной ход изменений fEPSP до и после введения парадигмы индукции LTD в срезах гиппокампа, полученных от фиктивных крыс и крыс r-mTBI при PID1. (F) Временной ход изменений fEPSP до и после введения парадигмы индукции LTD в срезах гиппокампа, полученных от фиктивных крыс и крыс r-mTBI при PID7. Сокращения: ACHI = закрытая черепно-мозговая травма в сознании; r-mTBI = повторная легкая черепно-мозговая травма; PID = день после травмы; fEPSP = полевозбуждающий постсинаптический потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Острые неврологические нарушения у ювенильных самцов крыс из-за r-mTBI с использованием модели ACHI. Крысы прошли восемь процедур ACHI с интервалом в 2 часа в течение 1 дня, при этом протокол неврологической оценки проводился на исходном уровне и после каждой травмы. NAP состоял из четырех задач: реакция на испуг, разгибание конечностей, ходьба луча и вращение луча. Каждое задание было оценено из 3, что дало в общей сложности 12 баллов за каждую сессию. Данные, представленные в виде среднего ± SEM. (*) указывает на p < 0,05. Сокращения: ACHI = закрытая черепно-мозговая травма в сознании; r-mTBI = повторная легкая черепно-мозговая травма; NAP = протокол неврологической оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица S1: Информация о животных и воздействии процедуры ACHI. Аббревиатура: ACHI = закрытая черепно-мозговая травма в сознании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Оценка сдержанности для мЧМТ в бодрствовании. Аббревиатура: mTBI = легкая черепно-мозговая травма. «Поворачиваться в сдержанности» относится к исследователю, помещающему животное в удерживающее устройство, прежде чем закрыть мешок вокруг хвоста. После того, как пакет закрыт, животное не должно иметь возможности развернуться. Вокализацию и извивание следует забивать после того, как мешок закрыт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Контрольный список мониторинга на стороне клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Шкала боли и контрольный список расширенного мониторинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В большинстве доклинических исследований использовались модели mTBI, которые не повторяют биомеханические силы, наблюдаемые в клинической популяции. Здесь показано, как модель ACHI может быть использована для индуцирования r-mTBI у молодых крыс. Эта закрытая модель р-мЧМТ имеет значительные преимущества по сравнению с более инвазивными процедурами. Во-первых, ACHI обычно не вызывает переломов черепа, кровоизлияний в мозг или смертельных исходов, что является противопоказанием «легкой» ЧМТ в клинических популяциях61. Во-вторых, АХИ не требует использования краниотомии, что важно, поскольку известно, что они вызывают воспалительные реакции, которые могут усугубить симптоматику и невропатологию67. В-третьих, АХИ не требует применения анестезии. Это также важно, так как анестезия может обладать нейропротекторными свойствами и может нарушать синаптическую пластичность, в дополнение к обучению и производительности памяти 48,49,50,51,68. Наконец, ACHI может вызывать тонкие преходящие изменения в неврологической функции, которые можно оценить сразу после травмы.

Поскольку ACHI обычно не вызывает потерю сознания или апноэ, эта модель имитирует mTBI в значительной части клинической популяции 69,70,71. Несмотря на это, модель ACHI привела к значительному снижению показателей NAP. Это снижение сохранялось при повторном введении процедуры ACHI, но не усугубляло сенсомоторные нарушения в группе r-mTBI. Это указывает на то, что модель ACHI вызывает легкую травму, аналогичную той, которая наблюдается после сотрясения мозга или субконтузии головы в клинических популяциях72,73. Основным преимуществом NAP является обнаружение тонкого поведенческого дефицита, наблюдаемого в остром периоде времени после r-mTBI. Это быстрое обследование может позволить исследователям классифицировать крыс на основе их поведенческих реакций. Тем не менее, использование более надежных поведенческих тестов в подострые и хронические моменты времени может быть необходимо для выявления моторной, когнитивной и аффективной симптомологии74,75,76. Важно отметить, что, хотя не было различий в показателях NAP по восьми травмам, на поведение грызунов могут влиять изменения в окружающей среде и знакомство с экспериментатором77,78. Крысам следует позволить акклиматизироваться в процедурном кабинете перед введением р-мЧМТ или фиктивных травм. Кроме того, важно, чтобы один человек отвечал за управление воздействиями, чтобы помочь обеспечить согласованность.

Несмотря на ранее упомянутые преимущества модели ACHI, она не лишена ограничений. Во-первых, парадигма была разработана таким образом, чтобы имитировать кумуляцию ударов за один сеанс, а не повторяющиеся травмы после восстановительного периода. После травмы мозг находится в окне церебральной уязвимости, которое простирается от 1 до 5 дней после травмы у грызунов 15,79,80. Получение восьми травм в один день не позволяет развиться каскадам острых и подострых травм. Поэтому, в зависимости от интересующего вопроса исследования, парадигма травмы может нуждаться в корректировке в рамках окна уязвимости. Во-вторых, несмотря на то, что полезно ограничить использование анестетика, непреднамеренным последствием модели ACHI является то, что крысы подвергаются стрессу сдерживания. Было показано, что воздействие острых и хронических стрессоров может инициировать воспалительную реакцию, влиять на различные виды поведения и изменять синаптическую пластичность гиппокампа81,82,83.

Описанный выше протокол обеспечивает четкий метод получения высококачественных поперечных срезов гиппокампа у животных, которым вводили r-mTBI, с моделью ACHI. Кроме того, протокол позволяет проводить стабильные электрофизиологические записи и показывает, что гиппокамп по-прежнему способен проявлять синаптическую пластичность после r-mTBI, хотя могут быть временные нарушения. При любых электрофизиологических записях здоровье срезов имеет первостепенное значение для способности записывать подходящие fEPSP. Чтобы сохранить мозговую ткань перед нарезкой, крайне важно, чтобы мозг оставался ледяным в карбогенированной спинномозговой жидкости. Удаление и нарезка мозга должны быть сделаны быстро, но не в том случае, если это происходит за счет ухода. В этом протоколе для молодых животных в качестве режущего раствора используется aCSF, но в зависимости от возраста животного могут потребоваться защитные режущие растворы (такие как растворы на основе холина, сахарозы, NMDG или глицерина)84,85,86.

Полевые электрофизиологические записи позволяют исследователям оценить синаптическую пластичность гиппокампа. Однако у этой техники есть ряд ограничений. Было показано, что процесс разрезания мозга вызывает изменения в позвоночнике под номером87, что может повлиять на синаптическую пластичность. Использование записей in vivo сохранит пути и позволит измерить синаптическую пластичность у анестезированных или живых животных88. Кроме того, использование полевых записей исследует свойства групп нейронов, но не информирует об изменениях в отдельных нейронах. Использование записей с помощью цельноклеточных пластырей может дать подробную информацию о свойствах нейронов в ответ на фармакологические или оптогенетические манипуляции89. Кроме того, сочетание электрофизиологических записей с дополнительными методами, такими как визуализация кальция, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия или электронная микроскопия, позволит исследователям получить представление о механизмах действия.

Когнитивный дефицит обычно сообщается после r-mTBI, и текущий протокол может помочь исследовать некоторые из основных физиологических процессов, связанных с этим дефицитом. В частности, мягкий характер процедуры ACHI открывает возможность изучения изменений в синаптической физиологии на протяжении всей жизни животных, перенесших r-mTBI. Модель ACHI, по-видимому, является экологически обоснованной моделью мЧМТ, которая может быть использована для изучения р-мЧМТ. Предварительные исследования с использованием модели ACHI показали острые неврологические нарушения без явных структурных повреждений, применяя одну, четыре и восемь парадигм повторной травмы61,90. В будущих исследованиях будет изучено, как are-mTBI может влиять на синаптическую пластичность в периоды развития и в стареющем мозге. Благодаря лучшему пониманию патофизиологии mTBI и r-mTBI для синаптической функции, мы надеемся лучше направить потенциальные терапевтические вмешательства, чтобы помочь снизить когнитивную функцию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим всех сотрудников Лаборатории Кристи в Университете Виктории, бывших и нынешних, за их вклад в разработку этого протокола. Этот проект был поддержан за счет средств Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR: FRN 175042) и NSERC (RGPIN-06104-2019). Рисунок черепа на рисунке 1 был создан с помощью BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

Неврология выпуск 191
Оценка изменений синаптической пластичности с использованием модели легкой черепно-мозговой травмы в сознании
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter