Summary
この論文では、成体マウス後根神経節に対する免疫パンニングプロトコルについて説明します。培養プレートに抗体を接着させることで、非神経細胞をネガティブに選択して除去することができます。このプロトコルを使用して、培養がニューロンに濃縮されていることを示し、操作に対するニューロン応答の詳細な研究を可能にします。
Abstract
後根神経節(DRG)は、脊髄の背角に隣接する末梢構造であり、感覚ニューロンの細胞体やその他のさまざまな種類の細胞を収容しています。公表されている培養プロトコルでは、線維芽細胞、シュワン細胞、マクロファージ、リンパ球が存在するにもかかわらず、解離したDRG培養全体がニューロンであると言及されることがよくあります。これらのDRG培養物全体は、形態または染色に基づいてニューロンを識別できるイメージングアプリケーションには十分ですが、これらの培養物から収集されたタンパク質またはRNAホモジネートは、主にニューロン起源ではありません。ここでは、培養マウスDRGのイムノパンニング配列について述べる。この方法の目標は、他の細胞タイプを除去することによってニューロンのDRG培養を濃縮することです。イムノパニングとは、細胞培養皿に抗体を接着させて細胞型を除去する方法を指します。これらのディッシュを使用すると、培養中の線維芽細胞、免疫細胞、およびシュワン細胞に対してネガティブに選択し、数を減らすことができます。この方法では、培養中のニューロンの割合を増やすことができます。
Introduction
背側根神経節(DRG)は、末梢組織を神経支配する感覚ニューロンの細胞体を収容します。これらのニューロンを研究することで、痛みや感覚状態の機構的基盤を理解することができます。しかし、DRGはニューロンのみから構成されるのではなく、線維芽細胞、シュワン細胞、マクロファージなどの免疫細胞も含んでいます1。これらの様々な細胞型が存在するにもかかわらず、DRG培養物全体は、文献ではニューロン2,3と呼ばれることが多い。これらの培養は、イメージングまたはフローサイトメトリーによるニューロンの調査に依然として有用であり、染色、細胞サイズ、および/または形態によるニューロンの同定を可能にします。ただし、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やウェスタンブロッティングなどのアッセイでは、RNAまたはタンパク質収集のために培養物をホモジナイズするため、非神経細胞型の存在が結果を妨げる可能性があります。したがって、DRG培養における神経細胞の割合を増やす必要があります。
イムノパニングは、皮質ニューロン、星状細胞、希突起膠細胞前駆細胞、ミクログリアなど、さまざまな種類の細胞を精製するために使用される技術です。簡単に言えば、特定の細胞に結合することを目的としたペトリ皿に細胞表面マーカーに対する抗体を接着することを含み(図1)、目的の細胞タイプに対してまたは反対のいずれかを選択するために使用できます4、5、6。非神経細胞に対して選択するイムノパニングラット胚性DRGsは、Zuchero7によって以前に記載されている。しかし、マウスDRGに特異的なイムノパンニングプロトコルは見つかっていませんでした。このプロトコルでは、Zucheroプロトコルの基本的なテナントに基づいて構築しますが、代わりにイムノパンニングシーケンスを適応させて成体マウスDRG培養を濃縮します(図2)。これは、培養において確立された感覚ニューロンを研究するための強力なツールです。遺伝的、疾患、および損傷モデルからの成体マウスの使用を可能にするので、それらの感覚ニューロンをより特異に研究することができるので有利である。
このプロトコルは、成体マウスDRG培養におけるニューロンの割合を増加させようとしている読者にとって有利です。ただし、イムノパニングステップを省略することもでき、このプロトコルはDRG培養全体にも使用できます。
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Protocol
すべての動物実験は、アルバータ大学健康科学動物管理および使用委員会(プロトコル0000274)の承認を得て実施されました。
1. 試薬調製
- 1日目には、次の試薬を準備します:細胞培養グレードの水;ポリ-D-リジン-ボトル全体を50 mLの培養グレードの水で100 μg/mLのストック濃度に再構成し、4°Cで保存し、ストックを培養グレードの水で1:10に希釈して最終濃度10 μg/mLに希釈してストックを準備します。トリス塩酸塩-粉末トリス塩酸塩を培養グレードの水に溶解してストック濃度500 mM(50 mL中3.94 g)、pH 9.5、フィルター滅菌(0.22 μm)、4°Cで保存し、ストックを培養グレードの水で1:10に希釈して最終濃度50 mMに調製します。二次抗体(ヤギ抗ラット、ウサギ、およびマウス)。
- 2日目には、以下の試薬を準備します。
- 細胞培養グレードのCa2+、Mg2+を含まないハンク平衡塩溶液(HBSS;HBSS-/-)、および細胞培養グレードのDリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をCa2+ およびMg2+で含有します。ラミニンストックアリコートを準備し、受け取ったらすぐに-80°Cで保存します。ストックを滅菌HBSS-/-で最終濃度10 μg/mLに希釈します。
- 400 mgのBSAを7.5 mLのD-PBS(pH 7.4)に溶解して4%ウシ血清アルブミン(BSA)ストックを調製し、容量を10 mLにし、ろ過滅菌(0.22 μm)、分注し、-20°Cで保存します。 750 μLの4%BSAを14.25 mLのD-PBSで希釈することにより、0.2%BSAを調製します。
- DNAse12,500単位あたり1 mLのアールズバランス塩溶液(EBSS)を加えて0.4%DNAseストックを調製し、フィルター滅菌(0.22 μm)、分注し、-20°Cで保存します。 27 mLのD-PBSに3 mLの0.2%BSAと100 μLの0.4%DNAseを加えて、パニングバッファー(0.02% BSA)を調製します。一次抗体(CD45、PDGRFβ、O4)を調製します。
注:このプロトコルはO4ハイブリドーマ8,9を使用しますが、市販のO4抗体10μgも適切です。 - コンビネーションコラゲナーゼ(50 mg)のボトルを5 mLのHBSS-/-に溶解してコンビネーションコラゲナーゼストックを調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。 4.5 mLのHBSS-/-に500 μLの加温コンビネーションコラゲナーゼと50 μLの加温した0.4%DNaseを加えて、2匹のマウスあたりのワーキングストックを調製します。
- 150 mLのD-PBSに3 gのBSAを加えて低オボムコイドを調製し、次に3 gのトリプシン阻害剤を加えて混合して溶解します。pHを7.4に調整し、D-PBSで容量を200mLまで上げます。ろ過滅菌し、1 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。 解剖当日、1 mLの低オボムコイドを9 mLのD-PBSに混ぜて作業溶液にします。
- 7.5 gのBSAを50 mLのHBSS-/-に溶解して15%BSAを調製し(振とう機に置いて完全に溶解)、ろ過滅菌して4°Cで保存します。
- DMEM23.2 mL、神経基底培地23.2 mL、グルタマックス500 μL、ピルビン酸ナトリウム500 μL、ペニシリン/ストレプトマイシン500 μL(到着直後に分注し、-20°Cで保存)、インスリン500 μL(最終5 μg/mL)、サトー500 μL、N-アセチル-L-システイン50 μL(NAC、最終5 μg/mL)を加えて、ニューロン培地50 mLを調製します。 1,000 μLのB27+(受け取りたらすぐに分注し、-20°Cで保存してください)。
- 培養グレードの水に0.5 mg/mL(100 mL中50 mg)の濃度に溶解してインスリンストックを調製し、pHを7.4に調整し、ろ過滅菌(0.22 μm)、500 μLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
- プロゲステロン20 μL(エタノール100 μL中2.5 mg)、亜セレン酸ナトリウム800 μL(神経基底培地10 mL + 1 N NaOH溶液10 μL)、BSA800 mg、トランスフェリン800 mg、プトレシン二塩酸塩128 mg、神経基底核80 mLを組み合わせて、サトーストックを調製します。フィルター滅菌(0.22 μm)、500 μLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。 新鮮なプロゲステロンと亜セレン酸ナトリウム溶液を作ることが不可欠です。
- N-アセチル-L-システイン(NAC)ストックを神経基底培地に溶解して50 μLをストック濃度5 mg/mL(10 mL中50 mg)に調製し、フィルター滅菌(0.22 μm)、分注し、-20°Cで保存します。
- 4日目と5日目には、以下の試薬を準備します。
- 21.8 gのリン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO 4)および8.34 gのリン酸ナトリウム一塩基二水和物(NaH 2 PO4)を1,000 mLの水に溶解することにより、0.2Mリン酸緩衝液(PB)を調製します。pHを7.4に調整し、室温で保存します。
- 次のように8%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備します:ドラフト内で、50 mLの水を55°Cに温め、火を止め、絶えず攪拌しながら8 gのPFAプリルを加えます。溶液が透明になるまで1 N NaOHを滴下し、次に40 mLの0.2 M PBを加え、透明になるまで攪拌を続けます。溶液を室温に冷却し、pHを7.4に調整し、0.2 M PBで容量を100 mLまで上げます。ろ過し、4°Cで最大2週間保存します。
- 培養グレードD-PBSに0.2%のトリトンX-100(1 mLのトリトン + 500 mLのD-PBS)を加えて、D-PBS + Triton X-100(PBSTX)を調製します。4°Cで保存してください。 PBSTX中の1%正常ロバ血清(NDS)であるブロッキング溶液を調製します。 事前に、1 mLのNDS + 9 mLのPBSTX を調製し、10 mLアリコートで-20°Cで保存することができます。
- PBSTX 中の0.2%NDS/0.2%BSAである抗体溶液を調製します:200 μLのNDS + 200 mg BSA + 9.6 mLのPBSTX;事前に調製し、10 mLアリコートで-20°Cで保存できます。
2.機器のセットアップ
- 次の機器をセットアップします:滅菌細胞培養バイオセーフティキャビネット、マイクロピペットセット、血清学的ピペットとピペットガン、10 cmペトリ皿、メッキ用の所望の細胞培養皿(ここでは、イメージングに24ウェルの黒いガラス底板を使用しました)、15 mLおよび50 mLのコニカルチューブ、解剖ツール(すなわち:椎弓切除術および神経トリミング用の細かいスプリングはさみ、細かい鉗子、 およびかみそりの刃)、37°Cに設定されたウォーターバス、70 μm細胞ストレーナー、15 mLコニカルチューブ用のアダプターを備えた遠心分離機(300 x gで10分)、トリパンブルーと血球計算盤、ヒュームフード、および磁気攪拌ホットプレート。
3. 実験方法
- 1日目:料理の準備
- バイオセーフティキャビネットで、ウェルの底を覆うのに十分なポリ-D-リジンで目的の培養表面をコーティングします。4°Cで一晩保存します。 ここでは、24ウェルのガラス底プレートをイメージングに使用したため、300 μLのポリD-リジンを使用しました。
- バイオセーフティキャビネットで、パンニングディッシュを準備します:CD45ディッシュの場合、10 mLの作業トリス塩酸塩溶液と30 μLのヤギ抗ラットIgGを10 cmのペトリ皿に加えます。PDGFRβディッシュの場合、10 mLの作業用トリス塩酸塩溶液と30 μLのヤギ抗ウサギIgGを10 cmのペトリ皿に加えます。O4ハイブリドーマディッシュの場合、10 mLのワーキングトリス塩酸塩溶液と30 μLのヤギ抗マウスIgGを10 cmのペトリ皿に加えます。溶液が皿領域全体を覆っていることを確認し、4°Cで一晩放置します。
- 2日目:解剖、摩砕、免疫パンニング
- ポリ-D-リジンを吸引し、組織培養水でプレートを3回洗浄し、蓋を傾けて開き、バイオセーフティキャビネットで表面を完全に乾燥させます。各ウェルの底をコーティングするのに十分なラミニンをプレートに塗布し、37°Cのインキュベーターに入れます。 24ウェルプレートの場合、200 μLで十分です。
- パン皿の準備を終了します。各皿をD-PBSで洗浄し、10μgの一次抗体でインキュベートします。室温で少なくとも2時間放置します。
- CD45ディッシュの場合、5 mLの0.2%BSAと20 μLのCD45プライマリーを追加します。PDGFRβディッシュの場合、5 mLの0.2%BSAと15.4 μLのPDGFRβを追加します。O4ディッシュには、3 mLの0.2%BSA、2 mLのO4ハイブリドーマ、および100 μLの4%BSAを追加します(最終的なBSA濃度が0.2%のままになるようにするため)。
- 0.1 mL / kgのペントバルビトールナトリウムを使用して1〜4匹のマウスを安楽死させます(10 cmイムノパニング皿あたり)。.8-10週齢のC57BL/6マウスを用いた。男女は互いに別々に使用され、培養されました。動物に30mLの冷たい0.9%生理食塩水を灌流する。
- 前足と後足を発泡スチロールのステージに固定し、きれいなかみそりの刃を使用して脊柱を後ろから露出させます。脊柱の両側を約半分の深さに切り込みを入れ、柱の背側半分を取り除き、脊髄を露出させることにより、椎弓切除術を行います。神経をそっと切って脊髄を取り除くか、神経の完全性を維持しながらコードをそっと横に押します。
- 脊髄神経根(切断または脊髄に付着)を使用して、脊柱の両側からすべてのDRGを見つけて除去します。各DRGから神経破片が除去されたら、それをトリミングします(培養物内の神経破片が多いと、培養の生存率が低下する可能性があります)。氷上で15 mLのコニカルチューブに15 mLのHBSS-/-でDRGを収集します。
注意: 組織は屋外で解剖されますが、DRGがチューブに追加されると、滅菌として扱われ、バイオセーフティキャビネットでのみ操作されることに注意してください。 - ステムキシム1および0.4%DNAseの凍結ストックを、解剖終了の約30分前(おおよそ最後のマウスを開始するとき)に水浴に入れます。それらを円錐形のチューブの底に落ち着かせてから、バイオセーフティキャビネットでプロトコルを続行します。
- DRGからHBSS-/-の大部分を吸引します。 吸引ではなくピペットを使用して<1 mLの液体を採取し、組織を失うリスクを冒さないように~100 μLの液体を残します。
- 1 mLのHBSS-/-で3回洗浄します。.5 mLの作業用ステムクサイム溶液を組織に加えます。蓋を透明なフィルムで覆い、チューブを横向きに37°Cに設定した水浴に1時間浮かせます。
- 酵素中でインキュベートした後、1 mLの低卵子阻害剤溶液をチューブに加えます。p1000ピペットで細胞を10〜15回穏やかに粉砕します。組織の塊が落ち着くのを待ちます。
- 溶液の上部2〜3 mL(解離した細胞を含む)を新鮮な低オボムコイド溶液に移します。組織が完全に解離し、目に見える塊がなくなるまで繰り返します。
- 室温で300 x g で10分間遠心分離します。最後の1 mLを吸引するのではなくピペットを使用して上清を再度吸い上げ、~100 μLを残し、細胞ペレットを1 mLのパンニングバッファーに再懸濁します。
- 穏やかにピペットで混ぜます。70 μmのセルストレーナーを1 mLのパンニングバッファーで50 mLのコニカルチューブ上でプリウェットします。細胞ストレーナーを通して細胞溶液を濾過する。
- チューブを1 mLのパンニングバッファーで洗浄し、ストレーナー(3 mLのろ液)を通過させます。細胞懸濁液を2 mLの15%BSAクッションの上に穏やかに(一度に1 mL)重ねて、ミエリンの破片を取り除きます。 2 mLのクッションは2匹のマウスに有効で、3 mLは4匹のマウスに有効です。
- 重ね合わせるには、 2 mLのBSAをチューブに入れ、チューブの側面をBSAで静かにコーティングします。次いで、上部の細胞懸濁液を、チューブの側面に対してピペッティングして穏やかに層状にする。
- 室温で300 x g で10分間遠心分離します(ゆっくりとした加速と減速)。P1000ピペットを使用して、上部の透明な液体、その間のミエリン相、およびBSAを一度に1 mLずつ除去します(各mL間のチップを交換します)。ペレットを乱さないように~100μLのBSAを残してください。
- 5 mLのパニングバッファーを加え、チューブを37°C、10%CO2 インキュベーターで30〜45分間インキュベートします。これにより、抗原賦活化が可能になります。ガス交換ができるように、必ずキャップを緩めてください。
- CD45皿をD-PBSで3回洗います。最後のすすぎを注ぎます。細胞懸濁液をCD45ディッシュにデカントします。
- CD45ディッシュ上で細胞を室温で合計20分間インキュベートし、10分ポイントで穏やかに旋回させて、細胞が抗体に等しくアクセスできるようにします。
- PDGFRβ皿をD-PBSで3回すすぎ、最後のすすぎを注ぎます。結合していない細胞をCD45ディッシュからPDGFRβディッシュに移します。
- CD45皿をそっと振って、斜めに支えます。細胞懸濁液1 mLをディッシュの上に静かにピペットで移し、結合していない細胞を回収します。それをPDGFRβディッシュとピペットにデカントして、残りの細胞懸濁液をPDGFRβプレートに移します。
- PDGFRβプレートを室温で合計20分間インキュベートし、10分間ポイントで穏やかに旋回させて、細胞が抗体に等しくアクセスできるようにします。
- O4皿をD-PBSで3回すすぎ、最後のすすぎを注ぎます。ステップ3.2.19と同じ方法を用いて、未結合細胞をPDGFRβディッシュからO4ディッシュに移す。O4プレートを室温で合計20分間インキュベートし、10分間ポイントで穏やかに旋回させて、細胞が抗体に等しくアクセスできるようにします。
- 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、300 x gで10分間遠心分離します。細胞を所望の容量に再懸濁し、細胞生存率のためにトリパンブルーで1:1に希釈します。血球計算盤で中型から大型の細胞をカウントします(これにより、培養中のニューロンの数を最もよく表現できます)。
- ラミニンを取り除き、細胞を希望の密度でプレートします。ラミニン除去とメッキの間にプレートを乾燥させないようにし、すぐに細胞を追加します。
- 定量したニューロン濃縮用細胞(図3)を、24ウェルプレートのウェルあたり25 μLの培養液(1.2.7に記載)中の500個のニューロンで培養し、37°Cで30分間インキュベートします。ウェルを最終容量500 μLまでフラッディングします。
- 4日目:免疫細胞化学(ICC)固定、ブロッキング、および一次
- 48時間の増殖後、500 μL/ウェル(またはウェル内の培地に相当する容量)の8%PFAを室温で15分間加え、細胞を固定します。メディア分析が必要な場合は、4%PFAで直接修正できます。ただし、これはテストしていません。
- 細胞をD-PBSで3回洗浄します。これらの細胞を培地交換なしで最大72時間培養に保持しましたが、特に培地が半分交換された場合、より長く生存できると仮定しています。
- 最終洗浄液を取り除き、細胞を完全に覆うのに十分なブロッキング溶液をウェルごとに加えます。室温で30分間ブロックします。ブロッキング溶液を除去し、抗体溶液に一次抗体β3-チューブリンを1:1,000希釈で加えます。プレートを透明フィルムで密封し、4°Cで一晩インキュベートします。
注:線維芽細胞がない場合はPDGFRβ、免疫細胞がない場合はCD45、ミエリンが存在しない場合はP0またはPMP22、サテライトグリアの場合はfabp7による染色を検討できます。
- 5日目:ICCセカンダリ
- 細胞をD-PBSで3回洗浄します。最終洗浄液を除去し、抗体溶液に二次抗体を加えます:抗ウサギ488を1:500希釈で、DAPIを1:2,000希釈で。光から保護された室温で30分間インキュベートします。
- D-PBSで3回洗ってください。ウェルの底を覆うのに十分なD-PBSを追加し、画像化します。プレートは透明フィルムで密封し、光から保護し、4°Cで最大2週間保存できます。
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Representative Results
次に、DAPIおよびβ3-チューブリンで染色した固定細胞を共焦点ハイコンテントスクリーニングシステムでイメージングしました。適切な市販のソフトウェアを用いて画像を解析し、β3-チューブリンと共標識したDAPI陽性細胞の割合を決定した(図3)。DRG培養物全体は42.36%±6.4%のβ3-チューブリン染色を有すると決定され、イムノパンされたDRG培養物は71.44%±7.43%β3-チューブリン染色を有すると決定された。これは、イムノパンニングによるニューロン濃縮の有意な増加を明らかにします(p < 0.0001、対応のないt検定)。
図1:イムノパニングの基本。 二次抗体を培養皿に一晩接着し、一次抗体を導入します。これにより、目的の細胞を表面抗原によってプレートに付着させることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ネガティブセレクションによる成体マウスDRGニューロンイムノパニング。 DRGは回収され、解離され、単一細胞溶液にひずみ込まれます。ミエリン破片は、BSAクッションを介した遠心分離によって除去される。次に、細胞懸濁液を3つのイムノパンニング皿(CD45、PDGFRβ、およびO4)に渡して、ニューロンに富む培養を実現します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:イムノパンニングによるDRG培養ニューロン濃縮。 固定培養は、ニューロンについてはβ3-チューブリン、すべての核についてはDAPIで染色した。(A)培養全体(非イムノパン)の代表像。(B)イムノパン培養物の代表像。(C)DAPI陽性細胞全体に占めるβ3チューブリン陽性細胞の割合としての定量。バーは平均値±標準誤差平均値(SEM)を示します。= p < 0.0001、対応のないt検定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このイムノパニングプロトコルは、DRG初代培養における神経細胞の割合を増加させます。最良の結果を得るには、解剖を適時に行い、DRGから余分な神経を取り除く必要があります。解離ステップは注意深く監視されるべきであり、細胞が不必要なストレスから生じるのを防ぐために1時間を超えてはならない。特にイムノパンニングに関しては、細胞がコーティングされた抗体にアクセスできるように、各プレートを中間点で穏やかに旋回させる必要があります。また、非神経細胞が結合していることを確認するために、ニューロン細胞懸濁液を採取した後、プレートを培養顕微鏡で観察する必要があります。
成体マウスの使用における制限は、DRGの確立された性質である。すべての非神経細胞タイプを除去できないと、培養物の約30%が非神経細胞のままになります(図3)。培養物から免疫細胞、線維芽細胞、シュワン細胞の集団を解離して減少させることはできますが、サテライトグリアはニューロンから解離するのが非常に難しい場合があります。また、これらのニューロンは、衛星グリア10によって提供される代謝サポートなしでは生存率が低下する可能性があるという仮説を立てています。GFAPを用いたこれらの細胞の染色の試みは、抗体の特異性が低いため失敗しましたが、将来の方向性は、fabp7を用いてこれらの細胞を染色することかもしれません。このプロトコルのトラブルシューティングを行う際に、サテライトグリアなどのCD9陽性の非神経細胞を除去しようとしました。しかし、CD9プレートでは、多くのニューロンがプレートに付着していることがわかった。我々は、マウスのニューロンが何らかのCD9発現を有する可能性があると仮定する。実際、マウスニューロン様細胞由来の細胞外小胞文献では、マーカー11としてCD9が採用されている。より適切なパンニング抗体がサテライトグリアの割合を減少させることがわかった場合、これらの支持細胞の喪失を打ち消すために、NGF、BDNF、またはNT3などの成長因子の追加補充を検討することができます。
このイムノパニングプロトコルは、培養中の神経細胞の割合を増やすことにより、均質なDRG培養サンプルからのニューロン読み出しの精度を向上させることができます。また、成体マウスのDRGニューロンを培養する手段を提供し、遺伝子、疾患、および損傷マウスモデルにおけるニューロン表現型の詳細な調査を可能にします。
イムノパニングも高度にカスタマイズ可能なツールです。例えば、細胞表面マーカーイソレクチン-B4は、非ペプチド作動性マウス侵害受容器を特異的に選択するために採用され得る。イムノパニングは、皮質ニューロン、ミクログリア、星状細胞、希突起膠細胞前駆細胞などの他の初代培養物を濃縮するためにも使用できます。初代細胞培養の用途を広げることができる強力なツールです。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ健康研究所からのプロジェクト助成金(FRN-162434)とカナダMS協会からのディスカバリー助成金(EGID-3761)によってサポートされました。著者らは、ImageXpressシステムのトレーニングと使用について、Sun博士とCross Cancer Instituteに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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