Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

Summary

Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell’Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l’opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell’interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.

Abstract

Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all’interno dell’organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell’ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell’organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l’architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all’interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.

Introduction

Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano¹. L’attuazione dei principi delle “3R” per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico². Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell’architettura biologica, della complessità cellulare e dell’ambiente meccanico necessari per ricapitolare la natura dinamica degli organi viventi umani ^3,4.

I sistemi preclinici convenzionali in vitro impiegano tipicamente monocolture 2D di cellule umane coltivate su una superficie plastica rigida. Questi metodi forniscono uno strumento per condurre semplici studi meccanicistici e consentono un rapido screening dei farmaci candidati. A causa del loro costo relativamente basso e dell’elevata robustezza, i modelli 2D sono spesso abbinati a sistemi automatici ad alta produttività e utilizzati per la rapida identificazione di potenziali candidati farmaci durante la fase iniziale del processo di sviluppo del farmaco ^5,6. Tuttavia, tali modelli 2D non forniscono un approccio traslazionale per la modellazione delle risposte a livello tissutale, a livello di organo o sistemiche ai candidati terapeutici, che è necessario per previsioni accurate della sicurezza e dell’efficacia dei farmaci durante la fase preclinica del loro sviluppo. Le colture cellulari piatte non ricapitolano il microambiente tissutale nativo, compresa la complessa interazione multicellulare, le proprietà biomeccaniche e l’architettura tridimensionale (3D) dei tessuti umani⁷. Le cellule che crescono su una superficie piana spesso non acquisiscono un fenotipo maturo e, quindi, non possono rispondere agli stimoli farmacologici come farebbero nel tessuto nativo. Ad esempio, le cellule epiteliali alveolari umane primarie coltivate in vitro mostrano un fenotipo squamoso e perdono marcatori fenotipici chiave, comprese le proteine tensioattive C e B (SP-C e SP-B)⁸. Oltre all’insufficiente differenziazione, le cellule primarie diventano spesso insensibili ai fattori di stress biologici in vitro, poiché alcuni percorsi biochimici associati all’infiammazione dei tessuti diventano non funzionali⁹. Tale perdita della funzione cellulare sembra essere principalmente associata all’uso di substrati rigidi e alla mancanza di fattori solubili rilasciati naturalmente dalle cellule stromali tessuto-specifiche come i fibroblasti polmonari e le cellule muscolari lisce^10,11.

Comprendere che la mancanza di complessità chemio-fisica e biologica limita il comportamento fisiologico delle cellule in vitro ha favorito lo sviluppo di modelli multicellulari più sofisticati, che hanno dimostrato di catturare meglio la complessità dei tessuti umani al di fuori del corpo^12,13. Dalla creazione dei primi modelli di co-coltura nei primi anni 1970¹⁴, l’introduzione di idrogel sintetici e naturali ha migliorato significativamente la capacità di imitare i microambienti tissutali nativi ed è diventato uno strumento inestimabile per guidare la differenziazione cellulare, guidare l’auto-organizzazione delle cellule in strutture simili ai tessuti e il ripristino delle funzioni tissutali native^15,16. Ad esempio, se coltivate nell’appropriata impalcatura 3D, le cellule umane possono auto-organizzarsi in strutture funzionali come sferoidi o organoidi, esprimendo marcatori di cellule staminali, e sono in grado di auto-rinnovarsi¹⁷. Al contrario, le cellule umane (comprese le cellule staminali), se coltivate su substrati 2D tradizionali, invecchiano rapidamente e subiscono la senescenza dopo pochi passaggi¹⁸. Inoltre, gli idrogel possono essere “personalizzati” per adattarsi a specifiche proprietà del tessuto come porosità, dimensione dei pori, spessore delle fibre, viscoelasticità, topografia e rigidità o ulteriormente ingegnerizzati con componenti cellulari derivati dai tessuti e / o molecole bioattive che consentono l’emulazione delle condizioni fisiologiche o patologiche^19,20. Nonostante il loro enorme potenziale per i test farmacologici, i modelli 3D basati sull’idrogel utilizzati nella ricerca farmaceutica non riassumono completamente la complessa citoarchitettura dei tessuti in vivo e mancano di importanti stimoli emodinamici e meccanici normalmente presenti nel corpo umano, tra cui pressione idrostatica, allungamento ciclico e taglio dei fluidi²¹.

I sistemi microfisiologici (MPS) come gli Organs-on-chip (OOC) sono recentemente emersi come strumenti in grado di catturare risposte fisiologiche complesse in vitro^22,23. Questi modelli utilizzano spesso l’uso di piattaforme microfluidiche, che consentono la modellazione del microambiente dinamico degli organi viventi.

Abbiamo combinato i principi della bioingegneria tissutale 3D e della meccanobiologia per creare un modello Open-Top Chip di tessuto epiteliale umano complesso. Questo ci ha permesso di ricapitolare da vicino il microambiente multicellulare e dinamico dei tessuti epiteliali. Ciò include segnali biochimici e biomeccanici specifici del tessuto naturalmente presenti negli organi viventi, ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro ²⁴. L’Open-Top Chip incorpora due compartimenti: un compartimento vascolare (Figura 1A) e un compartimento stromale (Figura 1B) separati da una membrana porosa, consentendo la diffusione dei nutrienti tra le due camere (Figura 1C). Il compartimento vascolare è esposto a flusso continuo di fluido per ricapitolare lo stress fisiologico di taglio, mentre il design estensibile della camera stromale consente di modellare la tensione meccanica associata ai movimenti respiratori o alla peristalsi intestinale. Il compartimento stromale ospita l’impalcatura idrogel 3D sintonizzabile progettata per supportare la crescita fisiologica dei fibroblasti tessuto-specifici. Possiede un coperchio rimovibile che facilita l’istituzione di un’interfaccia aria-liquido, una condizione che consente una maggiore emulazione della fisiologia umana dei tessuti della mucosa e l’accesso diretto al tessuto per la somministrazione di farmaci direttamente sullo strato epiteliale. La Figura 1 supplementare cattura alcuni dei componenti chiave del progetto Open-Top Chip, comprese le dimensioni e i compartimenti biologici (Figura supplementare 1A-D), nonché le principali fasi tecniche descritte in questo protocollo (Figura supplementare 1E).

La perfusione del chip Open-Top si ottiene con una pompa peristaltica programmabile (Figura 1D). La configurazione della pompa peristaltica consente di eseguire contemporaneamente 12 chip Open-Top. La maggior parte degli incubatori può ospitare due configurazioni che consentono la coltura di un massimo di 24 chip per incubatore. Lo stretching meccanico è ottenuto utilizzando un regolatore di pressione del vuoto programmabile su misura (Figura 1E). È costituito da un regolatore di vuoto elettropneumatico controllato elettronicamente da un convertitore digitale-analogico. In altre parole, il regolatore di vuoto elettropneumatico genera un profilo di vuoto sinusoidale con un’ampiezza e una frequenza determinate dall’utente. La deformazione ciclica compresa tra 0% e 15% viene generata applicando una pressione negativa al canale del vuoto del chip Open-Top ad un’ampiezza compresa tra 0 e -90 kPa e una frequenza di 0,2 Hz. Si tratta di un sistema su misura equivalente all’unità di deformazione Flexcell disponibile in commercio precedentemente adottata e descritta in altri documenti²⁵. Per imitare la deformazione meccanica del tessuto associata, ad esempio, al movimento respiratorio del polmone o alla peristalsi dell’intestino, l’attuatore pneumatico applica onde sinusoidali di vuoto/deformazione la cui grandezza e ampiezza possono essere regolate per corrispondere al livello fisiologico di deformazione e frequenza che le cellule umane sperimentano nel loro tessuto nativo.

Qui, descriviamo un metodo efficiente e riproducibile per ingegnerizzare e coltivare equivalenti di epitelio organotipico su una piattaforma prototipo Open-Top Chip. Consente la generazione di modelli di organi complessi come pelle, alveolo, vie aeree e colon, integrando un flusso di fluido vascolare e uno stretching meccanico. Descriveremo gli aspetti tecnici chiave che devono essere considerati durante l’implementazione dei principi dell’ingegneria tissutale per la generazione di modelli epiteliali complessi. Discuteremo i vantaggi e le possibili limitazioni del design attuale.

Una panoramica delle principali fasi utilizzate per ottenere la maturazione dei tessuti e degli organi, compresi i parametri di flusso e allungamento, è riportata in: Figura 2 per la pelle, Figura 3 per l’alveolo, Figura 4 per le vie aeree e Figura 5 per l’intestino. Ulteriori informazioni sulla composizione dei mezzi e sui reagenti utilizzati per la coltura dei diversi modelli di organi sono incluse nelle tabelle supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l’alveolo; Tabella supplementare 3 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l’intestino).

Protocol

I colonoidi umani sono stati ottenuti da resezioni intestinali in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza dell’ospedale pediatrico di Cincinnati (IBC 2017-2011). 1. Attivazione della superficie Preparazione del buffer di attivazionePosizionare il reticolante e i reagenti tampone solvente sotto l’armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti prima dell’uso. Ricos…

Representative Results

Micropatterning superficialeIl micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell’interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell’interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E</stro…

Discussion

L’Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l’integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie e…

Materials

10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] – Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647