İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması
Summary
Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip’in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.
Abstract
Neredeyse tüm insan organları, üç boyutlu (3B) yapılar halinde organize edilmiş, sıkıca bağlanmış hücrelerin bir veya daha fazla katmanından oluşan epitel dokularıyla kaplıdır. Epitelin temel işlevlerinden biri, altı çizili dokuları fiziksel ve kimyasal hakaretlere ve enfeksiyöz ajanlara karşı koruyan bariyerlerin oluşmasıdır. Ek olarak, epitel, besinlerin, hormonların ve diğer sinyal moleküllerinin taşınmasına aracılık eder ve genellikle organ içindeki hücre konumlandırmasını ve bölümlenmesini yönlendiren biyokimyasal gradyanlar oluşturur. Organ yapısını ve fonksiyonunu belirlemedeki merkezi rolleri nedeniyle, epitel, her zaman hayvan modelleri tarafından yakalanmayan birçok insan hastalığı için önemli terapötik hedeflerdir. Türler arası bariz farklılıkların yanı sıra, hayvanlarda epitelin bariyer fonksiyonu ve taşıma özellikleri üzerine araştırma çalışmaları yapmak, canlı bir sistemde bu dokulara erişmenin zorluğu ile daha da artmaktadır. İki boyutlu (2B) insan hücre kültürleri temel bilimsel soruları cevaplamak için yararlı olsa da, genellikle zayıf in vivo tahminler verirler. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yılda, çip üzerinde organlar olarak bilinen çok sayıda mikro mühendislik biyomimetik platform, geleneksel in vitro ve hayvan testlerine umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Burada, deri, akciğerler ve bağırsaklar dahil olmak üzere organa özgü epitel dokularını modellemek için tasarlanmış bir platform olan Open-Top Organ Chip’i (veya Open-Top Chip) açıklıyoruz. Bu çip, dokuya özgü fibroblastları ve endotel hücrelerini mekanik olarak aktif bir sisteme dahil ederek bir 3D stromal bileşeni yeniden oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere, epitel dokularının çok hücreli mimarisini ve işlevini yeniden oluşturmak için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu Open-Top Chip, epitelyal/mezenkimal ve vasküler etkileşimleri tek hücrelerden çok katmanlı doku yapılarına kadar çoklu çözünürlük ölçeklerinde incelemek için benzeri görülmemiş bir araç sağlar, böylece epitelize organların hücreler arası çapraz konuşmasının sağlık ve hastalıkta moleküler diseksiyonuna izin verir.
Introduction
Tarihsel olarak, bilim adamları ilaç keşfi için klinik öncesi hayvan testlerine güvenmişlerdir, ancak insan sonuçlarıyla zayıf korelasyon nedeniyle bu yöntemlerin giderek artan bir kısmı sorgulanmıştır1. Hayvan deneylerini Değiştirmek, Azaltmak ve İyileştirmek için “3R” ilkelerinin uygulanması, bilim insanlarını klinik öncesi ilaç ve kimyasal toksikoloji risk değerlendirmesini desteklemek için yeni in vitro alternatif yöntemler bulmaya çağırmaktadır2. Bununla birlikte, bugüne kadar geliştirilen birçok in vitro model, insan canlı organlarının dinamik doğasını özetlemek için gerekli biyolojik mimariden, hücresel karmaşıklıktan ve mekanik ortamdan yoksundur 3,4.
Geleneksel in vitro preklinik sistemler tipik olarak sert bir plastik yüzey üzerinde yetiştirilen insan hücrelerinin 2D monokültürlerini kullanır. Bu yöntemler, basit mekanik çalışmaların yürütülmesi için bir araç sağlar ve ilaç adaylarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Nispeten düşük maliyetleri ve yüksek sağlamlıkları nedeniyle, 2D modeller genellikle otomatik yüksek verimli sistemlerle eşleştirilir ve ilaç geliştirme sürecinin erken aşamasında potansiyel ilaç adaylarının hızlı bir şekilde tanımlanması için kullanılır 5,6. Bununla birlikte, bu tür 2D modeller, gelişimlerinin klinik öncesi aşamasında ilaç güvenliği ve etkinliğinin doğru tahminleri için gerekli olan terapötik adaylara doku seviyesi, organ düzeyinde veya sistemik yanıtları modellemek için translasyonel bir yaklaşım sağlamaz. Düz hücre kültürleri, karmaşık çok hücreli etkileşim, biyomekanik özellikler ve insan dokularının üç boyutlu (3B) mimarisi dahil olmak üzere doğal doku mikro ortamını özetlemez7. Düz bir yüzeyde büyüyen hücreler genellikle olgun bir fenotip kazanmazlar ve bu nedenle doğal dokuda olduğu gibi farmakolojik uyaranlara cevap veremezler. Örneğin, in vitro olarak yetiştirilen birincil insan alveoler epitel hücreleri skuamöz bir fenotip sergiler ve sürfaktan proteinleri C ve B (SP-C ve SP-B)8 dahil olmak üzere anahtar fenotipik belirteçleri kaybeder. Yetersiz farklılaşmaya ek olarak, birincil hücreler sıklıkla in vitro biyolojik stresörlere karşı duyarsız hale gelir, çünkü doku iltihabı ile ilişkili bazı biyokimyasal yollar fonksiyonel olmayan hale gelir9. Bu tür hücre fonksiyon kaybı, öncelikle sert substratların yanı sıra akciğer fibroblastları ve düz kas hücreleri gibi dokuya özgü stromal hücreler tarafından doğal olarak salınan çözünür faktörlerin eksikliği ile ilişkili görünmektedir10,11.
Kemo-fiziksel ve biyolojik karmaşıklık eksikliğinin in vitro hücrelerin fizyolojik davranışını sınırladığını anlamak, vücut dışındaki insan dokularının karmaşıklığını daha iyi yakaladığı kanıtlanmış daha sofistike çok hücreli modellerin geliştirilmesini teşvik etmiştir12,13. 1970’lerin başında ilk ko-kültür modellerinin oluşturulmasından buyana14, sentetik ve doğal hidrojellerin piyasaya sürülmesi, doğal doku mikro ortamlarını taklit etme yeteneğini önemli ölçüde geliştirmiş ve hücresel farklılaşmayı yönlendirmek, hücrelerin doku benzeri yapılara kendi kendini organize etmesine rehberlik etmek ve doğal doku fonksiyonlarının restorasyonu için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir15,16. Örneğin, uygun 3D iskelede yetiştirildiğinde, insan hücreleri sferoidler veya organoidler gibi fonksiyonel yapılara kendi kendine düzenleyebilir, kök hücre belirteçlerini eksprese edebilir ve kendini yenileyebilir17. Buna karşılık, insan hücreleri (kök hücreler dahil), geleneksel 2D substratlar üzerinde yetiştirildiğinde, birkaç pasajdan sonra hızla yaşlanır ve yaşlanmaya uğrar18. Ek olarak, hidrojeller gözeneklilik, gözenek boyutu, lif kalınlığı, viskoelastisite, topografya ve sertlik gibi spesifik doku özelliklerine uyacak şekilde “uyarlanabilir” veya fizyolojik veya patolojik koşulların öykünmesini sağlayan doku kaynaklı hücresel bileşenler ve / veya biyoaktif moleküller ile daha fazla mühendislik yapılabilir19,20. İlaç testi için muazzam potansiyellerine rağmen, farmasötik araştırmalarda kullanılan 3D hidrojel bazlı modeller, in vivo dokuların karmaşık sitomimarisini tam olarak özetlememektedir ve hidrostatik basınç, siklik gerilme ve sıvı makası21 dahil olmak üzere normalde insan vücudunda bulunan önemli hemodinamik ve mekanik uyaranlardan yoksundur.
Çip üzerinde organlar (OOC’ler) gibi mikrofizyolojik sistemler (MPS’ler) son zamanlarda in vitro22,23 karmaşık fizyolojik yanıtları yakalayabilen araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu modeller genellikle canlı organların dinamik mikro ortamının modellenmesini sağlayan mikroakışkan platformların kullanımını kullanır.
Karmaşık insan epitel dokusunun Open-Top Chip modelini oluşturmak için 3D doku biyomühendisliği ve mekanobiyoloji ilkelerini birleştirdik. Bu, epitel dokularının çok hücreli ve dinamik mikro ortamını yakından özetlememize izin verdi. Bu, canlı organlarda doğal olarak bulunan, ancak geleneksel in vitro modeller tarafından sıklıkla ihmal edilen dokuya özgü biyokimyasal ve biyomekanik ipuçlarını içerir24. Üstü Açık Çip iki bölmeden oluşur: bir vasküler bölme (Şekil 1A) ve gözenekli bir zarla ayrılmış bir stromal bölme (Şekil 1B), iki oda arasında besin maddelerinin difüzyonuna izin verir (Şekil 1C). Vasküler bölme, fizyolojik kayma stresini özetlemek için sürekli sıvı akışına maruz kalırken, stromal odanın gerilebilir tasarımı, solunum hareketleri veya bağırsak peristalsisi ile ilişkili mekanik gerilmenin modellenmesine izin verir. Stromal bölme, dokuya özgü fibroblastların fizyolojik büyümesini desteklemek için tasarlanmış ayarlanabilir 3D hidrojel iskelesini barındırır. Bir hava-sıvı arayüzünün kurulmasını kolaylaştıran çıkarılabilir bir kapağa sahiptir, bu durum mukozal dokuların insan fizyolojisinin daha fazla öykünmesine ve ayrıca ilaçların doğrudan epitel tabakasına uygulanması için dokuya doğrudan erişime izin veren bir durumdur. Ek Şekil 1, Boyutlar ve biyolojik bölmeler (Ek Şekil 1A-D) dahil olmak üzere Üstü Açık Çip tasarımının bazı önemli bileşenlerini ve bu protokolde açıklanan ana teknik adımları (Ek Şekil 1E) yakalar.
Üstü Açık Çipin perfüzyonu, programlanabilir bir peristaltik pompa ile sağlanır (Şekil 1D). Peristaltik pompa kurulumu, 12 Üstü Açık Talaş’ın aynı anda perfüze edilmesini sağlar. Çoğu inkübatör, inkübatör başına 24 talaşa kadar kültür sağlayan iki kuruluma ev sahipliği yapabilir. Mekanik germe, özel yapım programlanabilir bir vakum basınç regülatörü kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1E). Dijital-analog dönüştürücü tarafından elektronik olarak kontrol edilen bir elektro-pnömatik vakum regülatöründen oluşur. Başka bir deyişle, elektro-pnömatik vakum regülatörü, kullanıcı tarafından belirlenen bir genlik ve frekansa sahip bir sinüzoidal vakum profili oluşturur. %0 ila %15 arasında değişen döngüsel gerinim, Üstü Açık Çipin vakum kanalına 0 ila -90 kPa arasında değişen bir genlikte ve 0,2 Hz frekansında negatif basınç uygulanarak üretilir. Daha önce kabul edilen ve diğer makalelerde açıklanan ticari olarak temin edilebilen Flexcell Gerinim Ünitesine eşdeğer ısmarlama bir sistemdir25. Örneğin, akciğerin solunum hareketi veya bağırsağın peristalsisi ile ilişkili mekanik doku deformasyonunu taklit etmek için, pnömatik aktüatör, büyüklüğü ve genliği, insan hücrelerinin doğal dokularında yaşadıkları fizyolojik gerinim ve frekans seviyesine uyacak şekilde ayarlanabilen sinüzoidal vakum / gerinim dalgaları uygular.
Burada, prototip Open-Top Chip platformunda organotipik epitel eşdeğerlerinin mühendisliği ve kültürü için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz. Deri, alveolus, hava yolu ve kolon gibi karmaşık organ modellerinin oluşturulmasına izin verirken, vasküler sıvı akışını ve mekanik germeyi entegre eder. Karmaşık epitel modelleri oluşturmak için doku mühendisliği ilkelerini uygularken göz önünde bulundurulması gereken temel teknik hususları özetleyeceğiz. Mevcut tasarımın avantajlarını ve olası sınırlamalarını tartışacağız.
Akış ve gerilme parametreleri de dahil olmak üzere doku ve organ olgunlaşmasını sağlamak için kullanılan ana adımlara genel bir bakış aşağıda bildirilmiştir: Cilt için Şekil 2, alveolus için Şekil 3, hava yolu için Şekil 4 ve bağırsak için Şekil 5. Farklı organ modellerinin kültürlenmesinde kullanılan ortam bileşimi ve reaktifler ile ilgili ek bilgiler ek tablolarda yer almaktadır (Cilt için Ek Tablo 1; Alveolus için Ek Tablo 2; Hava yolu için Ek Tablo 3 ve bağırsak için Ek Tablo 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Open-Top Chip, kontrollü bir mikro ortamda endotel, stroma ve epitel arasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimi gerçek zamanlı olarak araştırmak için uygun bir platformu temsil eder. Bu teknoloji, akışkan kayma (akış), siklik germe ve mikrodesenleme yoluyla elde edilen epitel yüzey topografyasının yeniden yapılandırılması dahil olmak üzere insan dokusu mikroçevresini yeniden oluşturmakla ilgili fiziksel ve biyokimyasal ipuçlarının entegrasyonu gibi geleneksel organotipik ve o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse
Materials
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] – Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
