Reconstituindo a citoarquitetura e a função de tecidos epiteliais humanos em um chip de órgão de topo aberto

Summary

O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.

Abstract

Quase todos os órgãos humanos são revestidos por tecidos epiteliais, compreendendo uma ou várias camadas de células fortemente conectadas organizadas em estruturas tridimensionais (3D). Uma das principais funções do epitélio é a formação de barreiras que protegem os tecidos subjacentes contra insultos físicos e químicos e agentes infecciosos. Além disso, os epitélios mediam o transporte de nutrientes, hormônios e outras moléculas sinalizadoras, muitas vezes criando gradientes bioquímicos que guiam o posicionamento celular e a compartimentalização dentro do órgão. Devido ao seu papel central na determinação da estrutura e função do órgão, os epitélios são importantes alvos terapêuticos para muitas doenças humanas que nem sempre são capturadas por modelos animais. Além das óbvias diferenças espécie-espécie, a realização de pesquisas sobre a função de barreira e as propriedades de transporte de epitélios em animais é agravada pela dificuldade de acesso a esses tecidos em um sistema vivo. Embora as culturas de células humanas bidimensionais (2D) sejam úteis para responder a perguntas científicas básicas, elas geralmente produzem previsões in vivo pobres. Para superar essas limitações, na última década, uma infinidade de plataformas biomiméticas microprojetadas, conhecidas como organs-on-a-chip, emergiram como uma alternativa promissora aos testes tradicionais in vitro e em animais. Aqui, descrevemos um Open-Top Organ-Chip (ou Open-Top Chip), uma plataforma projetada para modelar tecidos epiteliais específicos de órgãos, incluindo pele, pulmões e intestinos. Este chip oferece novas oportunidades para reconstituir a arquitetura multicelular e a função dos tecidos epiteliais, incluindo a capacidade de recriar um componente estromal 3D incorporando fibroblastos tecido-específicos e células endoteliais dentro de um sistema mecanicamente ativo. Este Open-Top Chip fornece uma ferramenta inédita para estudar interações epiteliais/mesenquimais e vasculares em múltiplas escalas de resolução, desde células únicas até construções de tecido multicamadas, permitindo assim a dissecção molecular do crosstalk intercelular de órgãos epitelizados na saúde e na doença.

Introduction

Historicamente, os cientistas têm confiado em testes pré-clínicos em animais para a descoberta de drogas, mas um número crescente desses métodos tem sido questionado devido à fraca correlação com o resultado humano¹. A implementação dos princípios dos “3Rs” para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal insta os cientistas a encontrar novos métodos alternativos in vitro para apoiar a avaliação pré-clínica de risco toxicológico de drogas e produtos químicos². No entanto, muitos modelos in vitro desenvolvidos até o momento carecem da arquitetura biológica, complexidade celular e ambiente mecânico necessários para recapitular a natureza dinâmica dos órgãos vivos humanos ^3,4.

Os sistemas pré-clínicos in vitro convencionais tipicamente empregam monoculturas 2D de células humanas cultivadas em uma superfície plástica rígida. Esses métodos fornecem uma ferramenta para a realização de estudos mecanísticos simples e permitem a triagem rápida de candidatos a drogas. Devido ao seu custo relativamente baixo e alta robustez, os modelos 2D são frequentemente emparelhados com sistemas automáticos de alto rendimento e usados para a rápida identificação de potenciais candidatos a fármacos durante a fase inicial do processo de desenvolvimento de fármacos ^5,6. No entanto, tais modelos 2D não fornecem uma abordagem translacional para modelar respostas em nível de tecido, órgão ou sistêmica a candidatos terapêuticos, o que é necessário para previsões precisas de segurança e eficácia de medicamentos durante o estágio pré-clínico de seu desenvolvimento. As culturas de células planas não recapitulam o microambiente do tecido nativo, incluindo a complexa interação multicelular, as propriedades biomecânicas e a arquitetura tridimensional (3D) dos tecidos humanos⁷. As células que crescem em uma superfície plana muitas vezes não adquirem um fenótipo maduro e, portanto, não podem responder aos estímulos farmacológicos como responderiam no tecido nativo. Por exemplo, células epiteliais alveolares humanas primárias cultivadas in vitro exibem um fenótipo escamoso e perdem marcadores fenotípicos chave, incluindo as proteínas C e B do surfactante (SP-C e SP-B)⁸. Além da diferenciação insuficiente, as células primárias frequentemente tornam-se insensíveis a estressores biológicos in vitro, à medida que certas vias bioquímicas associadas à inflamação tecidual tornam-se não^funcionais9. Essa perda da função celular parece estar primariamente associada ao uso de substratos rígidos, bem como à falta de fatores solúveis liberados naturalmente pelas células estromais tecido-específicas, como fibroblastos pulmonares e células musculares^lisas10,11.

A compreensão de que a falta de complexidade físico-química e biológica limita o comportamento fisiológico das células in vitro tem fomentado o desenvolvimento de modelos multicelulares mais sofisticados, que têm demonstrado captar melhor a complexidade dos tecidos humanos fora do organismo^12,13. Desde a criação dos primeiros modelos de co-cultura no início da década de 1970¹⁴, a introdução de hidrogéis sintéticos e naturais melhorou significativamente a capacidade de mimetizar microambientes de tecidos nativos e tornou-se uma ferramenta inestimável para impulsionar a diferenciação celular, orientar a auto-organização das células em estruturas semelhantes a tecidos e restaurar as funções dos tecidos nativos^15,16. Por exemplo, quando cultivadas no arcabouço 3D apropriado, as células humanas podem se auto-organizar em estruturas funcionais, como esferoides ou organoides, expressando marcadores de células-tronco, e são capazes de se auto-renovar¹⁷. Em contraste, as células humanas (incluindo células-tronco), quando cultivadas em substratos 2D tradicionais, envelhecem rapidamente e sofrem senescência após algumas passagens¹⁸. Além disso, os hidrogéis podem ser “adaptados” para corresponder a propriedades específicas do tecido, como porosidade, tamanho dos poros, espessura da fibra, viscoelasticidade, topografia e rigidez, ou ainda projetados com componentes celulares derivados do tecido e/ou moléculas bioativas, permitindo a emulação das condições fisiológicas ou patológicas^19,20. Apesar de seu enorme potencial para testes de fármacos, os modelos 3D baseados em hidrogel utilizados em pesquisas farmacêuticas não recapitulam completamente a complexa citoarquitetura dos tecidos in vivo e carecem de importantes estímulos hemodinâmicos e mecânicos normalmente presentes no corpo humano, incluindo pressão hidrostática, estiramento cíclico e cisalhamento de fluidos²¹.

Sistemas microfisiológicos (MPSs) como os Organs-on-chips (OOCs) têm emergido recentemente como ferramentas capazes de captar respostas fisiológicas complexas in vitro^22,23. Esses modelos frequentemente empregam o uso de plataformas microfluídicas, que permitem a modelagem do microambiente dinâmico de órgãos vivos.

Combinamos os princípios da bioengenharia de tecidos 3D e da mecanobiologia para criar um modelo Open-Top Chip de tecido epitelial humano complexo. Isso nos permitiu recapitular de perto o microambiente multicelular e dinâmico dos tecidos epiteliais. Isso inclui pistas bioquímicas e biomecânicas tecido-específicas naturalmente presentes em órgãos vivos, mas frequentemente negligenciadas pelos modelos in vitro tradicionais²⁴. O Open-Top Chip incorpora dois compartimentos: um compartimento vascular (Figura 1A) e um compartimento estromal (Figura 1B) separados por uma membrana porosa, permitindo a difusão de nutrientes entre as duas câmaras (Figura 1C). O compartimento vascular é exposto ao fluxo contínuo de fluido para recapitular a tensão fisiológica de cisalhamento, enquanto o desenho esticável da câmara estromal permite a modelagem do estiramento mecânico associado aos movimentos respiratórios ou peristaltismo intestinal. O compartimento estromal abriga o arcabouço de hidrogel 3D ajustável projetado para suportar o crescimento fisiológico de fibroblastos específicos do tecido. Possui tampa removível que facilita o estabelecimento de uma interface ar-líquido, condição que permite maior emulação da fisiologia humana dos tecidos mucosos e acesso direto ao tecido para administração de fármacos diretamente na camada epitelial. A Figura 1 Suplementar captura alguns dos principais componentes do projeto do Open-Top Chip, incluindo dimensões e compartimentos biológicos (Figura Suplementar 1A-D), bem como as principais etapas técnicas descritas neste protocolo (Figura 1E Suplementar).

A perfusão do Open-Top Chip é realizada com bomba peristáltica programável (Figura 1D). A configuração da bomba peristáltica permite que 12 chips de topo aberto sejam perfundidos simultaneamente. A maioria das incubadoras pode abrigar duas configurações que permitem a cultura de até 24 chips por incubadora. O alongamento mecânico é obtido usando um regulador de pressão de vácuo programável sob medida (Figura 1E). Consiste em um regulador de vácuo eletropneumático controlado eletronicamente por um conversor digital-analógico. Em outras palavras, o regulador de vácuo eletropneumático gera um perfil de vácuo senoidal com amplitude e frequência determinadas pelo usuário. A deformação cíclica que varia de 0% a 15% é gerada pela aplicação de pressão negativa no canal de vácuo do Open-Top Chip em uma amplitude que varia de 0 a -90 kPa e uma frequência de 0,2 Hz. Trata-se de um sistema sob medida, equivalente à Unidade de Deformação Flexcell disponível comercialmente anteriormente adotada e descrita em outros trabalhos²⁵. Para mimetizar a deformação mecânica do tecido associada, por exemplo, ao movimento respiratório do pulmão ou ao peristaltismo do intestino, o atuador pneumático aplica ondas de vácuo/deformação sinusoidais cuja magnitude e amplitude podem ser ajustadas para corresponder ao nível fisiológico de deformação e frequência que as células humanas experimentam em seu tecido nativo.

Aqui, descrevemos um método eficiente e reprodutível para engenharia e cultivo de equivalentes de epitélio organotípico em um protótipo de plataforma Open-Top Chip. Permite a geração de modelos complexos de órgãos, como pele, alvéolo, vias aéreas e cólon, integrando fluxo de fluido vascular e alongamento mecânico. Descreveremos os principais aspectos técnicos que devem ser considerados na implementação dos princípios da engenharia de tecidos para a geração de modelos epiteliais complexos. Discutiremos as vantagens e possíveis limitações do desenho atual.

Uma visão geral das principais etapas utilizadas para alcançar a maturação dos tecidos e órgãos, incluindo os parâmetros de fluxo e estiramento, é relatada em: Figura 2 para a pele, Figura 3 para o alvéolo, Figura 4 para a via aérea e Figura 5 para o intestino. Informações adicionais sobre a composição dos meios e os reagentes utilizados para a cultura dos diferentes modelos de órgãos estão incluídas nas tabelas complementares (Tabela Suplementar 1 para a pele; Tabela Suplementar 2 para o alvéolo; Tabela Suplementar 3 para via aérea e Tabela Suplementar 4 para intestino).

Protocol

Os colonoides humanos foram obtidos de ressecções intestinais de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança do Hospital Infantil de Cincinnati (IBC 2017-2011). 1. Ativação de superfície Preparação do buffer de ativaçãoColoque o reticulante e os reagentes tampão de solvente sob a cabine de biossegurança (BSC) e deixe-os se equilibrar à temperatura ambiente (TR) por 10 minutos antes do uso. Reconstituir 5 mg de re…

Representative Results

Micropadronização de superfícieA micropadronização da matriz extracelular (MEC) pode ser usada para replicar a configuração espacial da interface das criptas intestinais. A configuração do Open-Top Chip pode ser modificada para integrar carimbos micropadronizados projetados especificamente para mimetizar a topografia natural da interface epitélio-estroma colônico (Figura 6A,B) e as criptas intestinais em escala micrométrica (Figura 6C-E<stron…

Discussion

O Open-Top Chip representa uma plataforma capacitadora para investigar a complexa interação celular que ocorre entre endotélio, estroma e epitélio em um microambiente controlado, em tempo real. Essa tecnologia oferece vantagens críticas sobre as culturas organotípicas e organoides convencionais, como a integração de pistas físicas e bioquímicas relevantes para a reconstituição do microambiente tecidual humano, incluindo cisalhamento fluídico (fluxo), estiramento cíclico e reconstrução da topografia da sup…

Materials

10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] – Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647