Modèle d’ischémie et de lésion de reperfusion chez le lapin

Summary

La présente étude démontre un modèle animal hautement reproductible d’ischémie myocardique régionale aiguë et de lésion de reperfusion chez le lapin en utilisant une mini-thoracotomie gauche pour les cas de survie ou une sternotomie médiane pour les cas de non-survie.

Abstract

Le protocole fournit ici une méthodologie simple et hautement reproductible pour induire in situ une ischémie myocardique régionale aiguë chez le lapin pour des expériences de non-survie et de survie. Le lapin adulte blanc de Nouvelle-Zélande est mis sous sédation avec de l’atropine, de l’acépromazine, du butorphanol et de l’isoflurane. L’animal est intubé et placé sous ventilation mécanique. Un cathéter intraveineux est inséré dans la veine marginale de l’oreille pour la perfusion de médicaments. L’animal est prémédiqué avec de l’héparine, de la lidocaïne et de la solution de Ringer lactée. Une réduction de la carotide est effectuée pour obtenir un accès à la ligne artérielle pour la surveillance de la pression artérielle. Certains paramètres physiologiques et mécaniques sont surveillés et enregistrés par une analyse continue en temps réel.

Une fois l’animal sous sédation et complètement anesthésié, on effectue soit une quatrième thoracotomie de l’espace intercostal gauche (survie), soit une sternotomie médiane (non-survie). Le péricarde est ouvert et l’artère descendante antérieure gauche (LAD) est située.

Une suture en polypropylène est passée autour de la deuxième ou de la troisième branche diagonale de l’artère LAD, et le filament de polypropylène est enfilé à travers un petit tube en vinyle, formant un piège. L’animal est soumis à 30 min d’ischémie régionale, obtenue en occlusant le LAD en resserrant le collet. L’ischémie myocardique est confirmée visuellement par une cyanose régionale de l’épicarde. Après une ischémie régionale, la ligature est relâchée et le cœur est autorisé à se reperfuser.

Pour les expériences de survie et de non-survie, la fonction myocardique peut être évaluée par une mesure échocardiographie (ECHO) du raccourcissement fractionnaire. Pour les études de non-survie, les données de sonométrie recueillies à l’aide de trois sondes ultrasoniques piézoélectriques numériques implantées dans la zone ischémique et la pression développée du ventricule gauche (LVDP) à l’aide d’un cathéter du ventricule gauche (VG) inséré apicalement peuvent être acquises en continu pour évaluer la fonction myocardique régionale et globale, respectivement.

Pour les études de survie, l’incision est fermée, une thoracentèse à l’aiguille gauche est effectuée pour l’évacuation de l’air pleural et le contrôle de la douleur postopératoire est réalisé.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde et contribuent à plus de 18 millions de décès chaque année ^1,2,3. L’infarctus aigu du myocarde (IM) est une urgence médicale courante qui se développe lorsqu’un caillot sanguin ou un morceau de plaque d’athérome bloque la circulation sanguine d’une artère coronaire. Cela provoque une ischémie myocardique régionale dans le territoire perfusé par l’artère.

La présente étude décrit un protocole qui utilise une méthodologie simple et fiable pour créer une ischémie myocardique régionale aiguë in situ dans un modèle de lapin pour des expériences de non-survie et de survie. L’objectif initial de cette méthode était d’évaluer les effets de la transplantation mitochondriale sur la modulation de la nécrose myocardique et l’augmentation de la fonction cardiaque post-ischémique à la suite d’un événement ischémique. Des recherches antérieures ont démontré l’apparition d’altérations mitochondriales et d’une baisse rapide des niveaux de phosphate à haute énergie après l’apparition de l’ischémie et une réduction de l’apport en oxygène, entraînant une diminution drastique des réserves d’énergie cardiaque⁴. Les chercheurs ont tenté d’améliorer la fonction post-ischémique et de réduire la nécrose du tissu myocardique à l’aide d’interventions pharmacologiques et/ou de techniques procédurales, mais ces techniques offrent une cardioprotection limitée et ont un impact minimal sur les lésions et le dysfonctionnement mitochondrial ^5,6,7. Notre équipe et d’autres ont déjà montré que les lésions mitochondriales se produisent principalement pendant l’ischémie et que la récupération contractile peut être améliorée et que la taille de l’infarctus du myocarde diminue avec la préservation de la fonction respiratoire mitochondriale pendant la reperfusion 8,9,10. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la transplantation mitochondriale de tissus non affectés par l’ischémie dans la zone d’ischémie avant la reperfusion fournirait une approche alternative pour réduire la nécrose myocardique et améliorer la fonction myocardique. Nous détaillons ici le protocole utilisé pour tester cette théorie et les résultats représentatifs obtenus à partir de l’analyse initiale de notre étude.

De plus, plusieurs chercheurs se sont penchés sur d’autres sujets essentiels à la définition de l’impact de l’ischémie-reperfusion myocardique et à la mise en place d’interventions thérapeutiques appropriées. L’un de ces domaines de recherche est celui du préconditionnement. Le préconditionnement ischémique myocardique est un mécanisme cardioprotecteur activé par un bref stress ischémique qui entraîne une réduction du taux de nécrose des cellules cardiaques lors d’épisodes ultérieurs d’ischémie prolongée. Ces mécanismes peuvent être activés par hypoxie ou occlusion coronaire. Mandel et al. ont démontré que le préconditionnement hypoxique-hyperoxique aidait à maintenir l’équilibre des métabolites de l’oxyde nitrique, à réduire l’hyperproduction d’endothéline-1 et à soutenir la protection des organes¹¹. De plus, le concept de préconditionnement ischémique à distance, un phénomène par lequel le préconditionnement d’un seul organe fournit une protection systémique, a été exploré. Ali et al. ont constaté que, chez les patients subissant une réparation élective de l’anévrisme de l’aorte abdominale ouverte, le préconditionnement à distance, effectué par clampage croisé intermittent de l’artère iliaque commune pour servir de stimulus, réduisait l’incidence des lésions myocardiques postopératoires, de l’infarctus du myocarde et de l’insuffisance rénale¹².

Les modèles de lapin offrent des avantages potentiels par rapport aux modèles avec d’autres espèces et ont été utilisés dans de multiples scénarios différents depuis des décennies, y compris l’induction d’arythmies, les modèles ischémiques mondiaux et régionaux et la recherche sur la contraction cardiaque, entre autres^13,14,15. Bien que le cœur de lapin soit plus petit que celui d’un chien ou d’un porc, il est suffisamment grand pour effectuer facilement des interventions chirurgicales à un coût beaucoup plus faible¹³. Le cœur de lapin est souvent utilisé car il est étroitement parallèle au cœur humain ; En effet, il a un taux métabolique similaire, exprime la chaîne lourde β-myosine, et n’a pas de xanthine oxydase¹⁶ myocardique significative. La technique décrite ici pour induire une ischémie myocardique régionale est simple, reproductible et rentable. Cette méthode permet à la fois des cas de non-survie et de survie, car seule l’ischémie régionale est induite plutôt que l’ischémie globale, et le matériel nécessaire n’est pas spécialisé. Deux approches chirurgicales différentes (c’est-à-dire la sternotomie et la mini-thoracotomie) peuvent être utilisées, offrant ainsi à l’opérateur et aux protocoles expérimentaux une plus grande liberté en termes de conception de l’étude. De plus, la procédure ne nécessite pas l’utilisation d’un pontage cardiopulmonaire. Dans ce contexte, les approches mini-invasives du pontage aortocoronarien sont devenues des alternatives précieuses pour les patients ayant besoin d’une revascularisation multivasculaire^17,18. Ce modèle pourrait être utilisé pour étudier les différences entre ces approches et fournir un outil d’apprentissage basé sur l’animal pour les stagiaires en chirurgie. De plus, la réalisation d’un cathétérisme cardiaque à l’aide de ce modèle peut être utile pour la recherche physiologique et/ou la formation chirurgicale.

Notre modèle fournit une méthodologie pour les applications dans lesquelles l’induction d’une ischémie myocardique régionale et la mesure ultérieure de la taille de l’infarctus, de la fonction myocardique et des changements cellulaires sont importantes. Avec ce protocole, nous avons pu évaluer plusieurs marqueurs de la fonction cellulaire et de l’adaptation à l’ischémie et à l’intervention thérapeutique proposée (i.e., transplantation mitochondriale) en examinant l’internalisation des organites, la consommation d’oxygène, la synthèse de phosphate à haute énergie et l’induction de médiateurs cytokiniques et de voies protéomiques. Ces résultats sont importants pour préserver l’énergétique du myocarde, la viabilité cellulaire et la fonction cardiaque et permettent l’évaluation objective des techniques cardioprotectrices à la suite d’une lésion d’ischémie-reperfusion. Ce modèle pourrait être utilisé pour étudier des voies biologiques similaires et des alternatives dans le domaine de la pathologie myocardique post-ischémique et du rétablissement.

L’objectif de ce protocole est de fournir une méthodologie hautement reproductible pour induire in situ une ischémie myocardique régionale aiguë chez le lapin pour des expériences de non-survie et de survie. Ce modèle fournit une méthodologie avec un taux de survie élevé, une faible mortalité peropératoire et une morbidité minimale¹⁹. D’autres modèles d’ischémie myocardique régionale aiguë ont été décrits à l’aide de matériaux radiomarqués, d’agents de contraste, d’imagerie par résonance magnétique ou de simulations informatiques^20,21,22. Notre protocole fournit une méthodologie fiable et simple, rentable, reproductible de manière cohérente et à faible exigence technique et, par conséquent, peut être réalisée par des investigateurs sans expertise chirurgicale. Ce protocole s’adapte soit à un projet de survie utilisant une mini-thoracotomie gauche, soit à un modèle de non-survie utilisant une sternotomie médiane.

Protocol

Cette enquête a été menée conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health sur les soins et l’utilisation des animaux et a été approuvée par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’hôpital pour enfants de Boston (protocole 20-08-4247R). Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Espèces animales, agents anesthésiques et analgésiques</stron…

Representative Results

Suivant le protocole (Figure 1), l’ischémie myocardique a été confirmée immédiatement par la visualisation directe de la cyanose de l’épicarde. Des ECG standard (trois dérivations de membres : I, II et III, et trois dérivations augmentées par ordinateur : aVL, aVR et aVF) ont été enregistrées en continu avant l’ischémie, pendant l’ischémie et à la reperfusion (Figure 2). Les ECG mettent en évidence une tachycar…

Discussion

Notre protocole démontre une méthodologie fiable pour réaliser une ischémie myocardique régionale aiguë chez le lapin. L’approche de la mini-thoracotomie gauche est idéale pour les cas de survie, pour lesquels l’incision et la douleur associée doivent être minimisées. Il est important de noter que le traitement diurétique n’était pas nécessaire avant l’extubation et qu’il n’y avait pas de mortalité peropératoire dans le groupe non survie ou à 4 semaines postopératoire dans le groupe survie. L…

Materials

#10 blade	Bard Parker	371210
#11 blade	Fisher Scientific	B3L
22 G PIV needle	BD Insyte	381423
Acepromazine	VETONE	NDC 13985-587-50	0.5 mg/kg IM and IV
Aline pressure bag	Infu-Stat	2139
Angiocath	Becton Dickinson	382512
Arterial Catheter	Teleflex	MC-004912
Atropine	Hikma Pharmaceuticals	NDC 0641-6006-01	0.01 mg/kg IM
Betadine and 70% isopropyl alcohol	McKesson	NDC 68599-2302-6
Blood gas machine	Siemens	MRK0025
Bovie	Valleylab	E6008
Bulldog clamps	World Precision Instruments	14119
Bupivacaine	Auromedics	NDC 55150-249-50	3 mg/kg IM
Butorphanol	Roxane	NDC 2054-3090-36	0.5 mg/kg IM
Clear acetate sheet	Oxford Instruments	ID 51-1625-0213
Clipers	Andis	AGC2
DeBakey forceps	Integra	P6280
Echocardiography machine	Philips	IE33 F1
Electrocardiography machine	Meditech	MD908B
Endotracheal tube	Medline	#922774
Fentanyl	West-Ward	NDC 0641-6030-01	1–4 µg/kg transdermal patch
Formaldehyde solution 10%	Epredia	94001
Glass plates	United Scientific	B01MUHX6MR
Heparin Sodium	Sagent	NDC 69-0058-02	1000U in 1 mL 3 mg/kg
Hot water blanket	3M	55577
Isoflurane	Penn Veterinary Supply, INC	NDC 50989-606-15	1%–3%
Ketamine	Dechra	NDC 42023-138-10	10 mg/kg IV
Lab Chart 7 Acquisition Software	Adinstruments
Lactated Ringer's solution	ICUmedical	NDC 0990-7953-09	10 mL/kg/h
Laryngoscope	Welch Allyn	68044
Left ventricule lumen catheter 3Fr	McKesson	385764-EA
Lidocaine (1%)	Pfizer	4276-01	1–1.5 mL/kg IV
LVDP transducer	Edward	PDP-ED
Marking pen	Viscot	1451SR-100 Unsterile
Mayo scissors	Mayo	S7-1098
Medetomidine	Entireoly Pets Pharmacy	NDC 015914-005-01	0.25 mg/kg IM
Metzenbaum scissors	Cole-Parmer	UX-10821-05
Monastra. Blue pigment 98%	Chemsavers	MBTR1100G
Monocryl 5-0	Ethicon	Y463G
Mosquito clamp	Shioda	802N
PDS 3-0	Ethicon	42312201
Piezoelectric sonomicrometry crystals	Sonometrics	Small 2mm round
Plegets	DeRoyal	32-363
Povuine Iodine Prep Solutions	Medline	MDS093940
Precision vaporized system face mask	Yuwell	B07PNH69BF
Prolene 3-0	Ethicon	8665G
Proline 5-0	Ethicon	8661G
Pulse oximetry probe	Masimo	9216-U
Rib spreader	Medline	MDS5621025
S12 Pediatric Sector Probe	Phillips	21380A
Sonomicrometer	Sonometrics	BZ10123724
Sterile gauze	Medline	3.00802E+13
Sterile towels	McKesson	MON 277860EA
Sternal retractor	Medline	MDS5610321
Sutures for closure	J&J Dental	8698G
Telemetriy monitor	Meditech	MD908B
Temperature probe	Omega	KHSS-116G-RSC-12
Triphenyl tetrazolium chloride (1%)	Millipore	MFCD00011963
Ventilator	MedGroup	MSLGA 11
Vicryl 2-0	Ethicon	V635H
Vinyl tubing	ABE	DISW 3001