מודל של איסכמיה ופגיעה רפרפוזיה בארנבים
Summary
המחקר הנוכחי מדגים מודל בעל חיים בעל יכולת שחזור גבוהה של איסכמיה אזורית חריפה של שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה בארנבים באמצעות מיני בית חזה שמאלי למקרי הישרדות או עצם סטרנטומיה בקו האמצע למקרים שאינם הישרדותיים.
Abstract
הפרוטוקול כאן מספק מתודולוגיה פשוטה וניתנת לשכפול כדי לגרום לאיסכמיה אזורית חריפה באתרו של שריר הלב בארנב לניסויים שאינם הישרדותיים והישרדותיים. ארנב בוגר לבן מניו זילנד מורדם באטרופין, אצפרומזין, בוטורפנול ואיזופלורן. החיה מוחדרת ומונחת על אוורור מכני. קטטר תוך ורידי מוכנס לווריד האוזן השולי לעירוי תרופות. בעל החיים מקבל תרופות מקדימות עם הפרין, לידוקאין ותמיסת רינגר הנקה. כריתת התרדמה מבוצעת כדי להשיג גישה לקו העורקים לניטור לחץ דם. פרמטרים פיזיולוגיים ומכניים נבחרים מנוטרים ונרשמים על ידי ניתוח רציף בזמן אמת.
עם בעל החיים מורדם ומורדם לחלוטין, או חלל בין-קוסטלי רביעי קטן בית החזה השמאלי (הישרדות) או סטרנטומיה קו האמצע (לא הישרדות) מבוצעת. קרום הלב נפתח, והעורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) נמצא.
תפר פוליפרופילן מועבר סביב הענף האלכסוני השני או השלישי של עורק LAD, ונימה פוליפרופילן מושחל דרך צינור ויניל קטן, ויוצר snare. החיה נתונה ל -30 דקות של איסכמיה אזורית, המושגת על ידי הסתרת LAD על ידי הידוק הסנר. איסכמיה שריר הלב מאושרת חזותית על ידי ציאנוזה אזורית של אפיקרדיום. בעקבות איסכמיה אזורית, הרצועה מתרופפת, והלב מורשה לנקר מחדש.
הן בניסויי הישרדות והן בניסויים שאינם הישרדותיים, ניתן להעריך את תפקוד שריר הלב באמצעות מדידת אקוקרדיוגרפיה (ECHO) של קיצור השבר. עבור מחקרים שאינם הישרדותיים, ניתן לרכוש ברציפות נתונים מסונומיקרומטריה שנאספו באמצעות שלוש בדיקות על-קוליות פיאזואלקטריות דיגיטליות שהושתלו באזור האיסכמי והלחץ המפותח בחדר השמאלי (LVDP) באמצעות צנתר חדר שמאל (LV) המוחדר באופן אפי להערכת תפקוד שריר הלב האזורי והעולמי, בהתאמה.
עבור מחקרי הישרדות, החתך סגור, thoracentesis מחט שמאל מבוצעת עבור פינוי אוויר pleural, ולאחר הניתוח שליטה בכאב מושגת.
Introduction
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם ותורמות ליותר מ -18 מיליון מקרי מוות מדי שנה 1,2,3. אוטם שריר הלב חריף (MI) הוא מצב חירום רפואי נפוץ המתפתח כאשר קריש דם או חתיכת רובד טרשתי חוסם את זרימת הדם של עורק כלילי. זה גורם איסכמיה שריר הלב באזור כי העורק מחורר.
המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול המשתמש במתודולוגיה פשוטה ואמינה ליצירת איסכמיה אזורית חריפה באתרה במודל ארנב לניסויים שאינם הישרדותיים והישרדותיים. המטרה הראשונית של שיטה זו הייתה להעריך את ההשפעות של השתלת מיטוכונדריה על ויסות נמק שריר הלב והגברת תפקוד הלב הפוסט-איסכמי לאחר אירוע איסכמי. מחקרים קודמים הדגימו התרחשות של שינויים במיטוכונדריה וירידה מהירה ברמות פוספט באנרגיה גבוהה בעקבות הופעת איסכמיה וירידה באספקת החמצן, וכתוצאה מכך ירידה דרסטית במאגרי האנרגיה הלבבית4. חוקרים ניסו לשפר את התפקוד הפוסט-איסכמי ולהפחית נמק של רקמת שריר הלב באמצעות התערבויות פרמקולוגיות ו / או טכניקות פרוצדורליות, אך טכניקות אלה מספקות הגנה מוגבלת על הלב ויש להן השפעה מינימלית על נזק מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי 5,6,7. הצוות שלנו ואחרים הראו בעבר כי נזק מיטוכונדריאלי מתרחש בעיקר במהלך איסכמיה וכי ניתן לשפר את התאוששות ההתכווצות ולהקטין את גודל אוטם שריר הלב עם שימור תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלית במהלך זילוח 8,9,10. לפיכך, שיערנו כי השתלת מיטוכונדריה מרקמות שאינן מושפעות מאיסכמיה לאזור האיסכמיה לפני הזילוח תספק גישה חלופית להפחתת נמק שריר הלב ולשיפור תפקוד שריר הלב. במאמר זה אנו מפרטים את הפרוטוקול ששימש לבדיקת תיאוריה זו ואת התוצאות המייצגות שהתקבלו מניתוח המחקר הראשוני שלנו.
יתר על כן, מספר חוקרים התמקדו בנושאים אחרים המהווים חלק בלתי נפרד מהגדרת ההשפעה של פגיעה באיסכמיה של שריר הלב ובקביעת התערבויות טיפוליות מתאימות. תחום מחקר אחד כזה הוא זה של התניה מוקדמת. התניה מוקדמת איסכמית של שריר הלב היא מנגנון הגנה על הלב המופעל על ידי לחץ איסכמי קצר המביא לירידה בשיעור נמק תאי הלב במהלך פרקים עוקבים של איסכמיה ממושכת. מנגנונים אלה יכולים להיות מופעלים על ידי היפוקסיה או חסימה כלילית. מנדל ועמיתיו הדגימו כי התניה מוקדמת היפוקסית-היפראוקסית סייעה לשמור על איזון המטבוליטים של תחמוצת החנקן, הפחיתה את ייצור היתר של אנדותלין-1 ותמכה בהגנה על איברים11. יתר על כן, נחקר הרעיון של התניה מוקדמת איסכמית מרחוק, תופעה לפיה התניה מוקדמת של איבר יחיד מספקת הגנה מערכתית. עלי ועמיתיו מצאו כי בחולים שעברו תיקון אלקטיבי של מפרצת אבי העורקים הפתוח בבטן, התניה מוקדמת מרחוק, המבוצעת על ידי הידוק צולב לסירוגין של העורק האיליאק המשותף כדי לשמש כגירוי, הפחיתה את השכיחות של פגיעה בשריר הלב לאחר הניתוח, אוטם שריר הלב ופגיעה כלייתית12.
מודלים של ארנבים מציעים יתרונות פוטנציאליים על פני מודלים עם מינים אחרים ושימשו במספר תרחישים שונים במשך עשרות שנים, כולל השראת הפרעות קצב, מודלים איסכמיים גלובליים ואזוריים, ומחקר התכווצות לב, בין היתר13,14,15. למרות שלב הארנב קטן יותר מזה של כלב או חזיר, הוא גדול מספיק כדי לבצע בקלות הליכים כירורגיים בעלות נמוכה בהרבה13. לב הארנב משמש לעתים קרובות מכיוון שהוא מקביל מאוד ללב האנושי; ואכן, יש לו קצב חילוף חומרים דומה, מבטא שרשרת כבדה של β-מיוזין, וחסר קסנטין אוקסידאז משמעותי בשריר הלב16. הטכניקה המתוארת כאן לגרימת איסכמיה אזורית של שריר הלב היא פשוטה, חוזרת על עצמה וחסכונית. שיטה זו מאפשרת הן מקרי הישרדות והן מקרי הישרדות, שכן רק איסכמיה אזורית נגרמת ולא איסכמיה גלובלית, והחומרים הדרושים אינם מיוחדים. ניתן להשתמש בשתי גישות כירורגיות שונות (כלומר, סטרנוטומיה ומיני תורקוטומיה), ובכך לספק לפרוטוקול המפעיל והניסוי חופש רב יותר מבחינת תכנון המחקר. בנוסף, ההליך אינו מחייב שימוש במעקף לב-ריאה. בהקשר זה, גישות זעיר פולשניות להשתלת מעקפים של עורקים כליליים הפכו לחלופות בעלות ערך עבור חולים הזקוקים ל- multi-vessel revascularizaiton17,18. מודל זה יכול לשמש לחקר ההבדלים בין גישות אלה ולספק כלי למידה מבוסס בעלי חיים למתמחים כירורגיים. בנוסף, ביצוע צנתור לב באמצעות מודל זה עשוי להיות שימושי למחקר פיזיולוגי ו / או הכשרה כירורגית.
המודל שלנו מספק מתודולוגיה ליישומים שבהם יש חשיבות לגרימת איסכמיה אזורית של שריר הלב ולאחר מכן למדידת גודל האוטם, תפקוד שריר הלב ושינויים תאיים. בעזרת פרוטוקול זה, הצלחנו להעריך מספר סמנים של תפקוד תאי והסתגלות לאיסכמיה ואת ההתערבות הטיפולית המוצעת (כלומר, השתלת מיטוכונדריה) על ידי בחינת הפנמת אברונים, צריכת חמצן, סינתזת פוספט באנרגיה גבוהה והשראת מתווכי ציטוקינים ומסלולים פרוטאומיים. תוצאות אלה חשובות לשימור אנרגטיקת שריר הלב, יכולת הקיום של התאים ותפקוד הלב ומאפשרות הערכה אובייקטיבית של טכניקות הגנה על הלב לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה. מודל זה יכול לשמש לחקר מסלולים ביולוגיים דומים וחלופות בתחום הפתולוגיה וההתאוששות של שריר הלב הפוסט-איסכמי.
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתודולוגיה הניתנת לשחזור כדי לגרום לאיסכמיה אזורית חריפה באתרה של שריר הלב בארנב לניסויים שאינם הישרדותיים והישרדותיים. מודל זה מספק מתודולוגיה עם הישרדות גבוהה, תמותה תוך ניתוחית נמוכה ותחלואה מינימלית19. מודלים אחרים לאיסכמיה חריפה של שריר הלב תוארו באמצעות חומרים בעלי תווית רדיו, חומרי ניגוד, דימות תהודה מגנטית או הדמיות מחשב20,21,22. הפרוטוקול שלנו מספק מתודולוגיה אמינה ופשוטה, חסכונית, ניתנת לשחזור באופן עקבי ובעלת ביקוש טכני נמוך, ולכן יכולה להתבצע על ידי חוקרים ללא מומחיות כירורגית. פרוטוקול זה מתאים לפרויקט הישרדות באמצעות מיני חזה שמאלי או מודל שאינו הישרדותי באמצעות סטרנוטומיה בקו האמצע.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שלנו מדגים מתודולוגיה אמינה לביצוע איסכמיה אזורית חריפה של שריר הלב בארנב. גישת מיני חזה שמאל אידיאלית למקרי הישרדות, שעבורם יש למזער את החתך ואת הכאב הנלווה. חשוב לציין, טיפול משתן לא היה הכרחי לפני אקסטובציה, ולא הייתה תמותה תוך ניתוחית בקבוצת הלא הישרדות או 4 שבועות לאחר הניתו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר המקורי שבו נעשה שימוש בפרוטוקול זה נתמך על ידי מענקי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם HL-103642 ו- HL-088206
Materials
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
- Selvin, E., Erlinger, T. P. Prevalence of and risk factors for peripheral arterial disease in the United States: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2000. Circulation. 110 (6), 738-743 (2004).
- Bolli, R., et al. Myocardial protection at a crossroads: The need for translation into clinical therapy. Circulation Research. 95 (2), 125-134 (2004).
- Cohn, J. N., et al. Report of the National Heart, Lung, and Blood Institute Special Emphasis Panel on Heart Failure Research. Circulation. 95 (4), 766-770 (1997).
- Rousou, A. J., Ericsson, M., Federman, M., Levitsky, S., McCully, J. D. Opening of mitochondrial KATP channels enhances cardioprotection through the modulation of mitochondrial matrix volume, calcium accumulation, and respiration. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (5), H1967-H1976 (2004).
- Rao, V., et al. Insulin cardioplegia for elective coronary bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 119 (6), 1176-1184 (2000).
- Vinten-Johansen, J., Zhao, Z. Q., Jiang, R., Zatta, A. J. Myocardial protection in reperfusion with postconditioning. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 3 (6), 1035-1045 (2005).
- Wakiyama, H., et al. Selective opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels during surgically induced myocardial ischemia decreases necrosis and apoptosis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 21 (3), 424-433 (2002).
- Chen, Q., Moghaddas, S., Hoppel, C. L., Lesnefsky, E. J. Reversible blockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial injury following reperfusion. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 319 (3), 1405-1412 (2006).
- Lesnefsky, E. J., et al. rather than reperfusion, inhibits respiration through cytochrome oxidase in the isolated, perfused rabbit heart: Role of cardiolipin. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), H258-H267 (2004).
- McCully, J. D., Rousou, A. J., Parker, R. A., Levitsky, S. Age- and gender-related differences in mitochondrial oxygen consumption and calcium with cardioplegia and diazoxide. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (3), 1102-1109 (2007).
- Mandel, I. A., et al. Influence of hypoxic and hyperoxic preconditioning on endothelial function in a model of myocardial is-chemia-reperfusion injury with cardiopulmonary bypass (Experimental study). International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5336 (2020).
- Ali, Z. A., et al. Remote ischemic preconditioning reduces myocardial and renal injury after elective abdominal aortic aneurysm repair: A randomized controlled trial. Circulation. 116, 98-105 (2007).
- Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discovery Today: Disease Models. 5 (3), 185-193 (2008).
- Tanaka, K., Hearse, D. J. Reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rabbit heart: characterization of the influence of the duration of regional ischemia and the extracellular potassium concentration. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 20 (3), 201-211 (1988).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Gupta, M. P. Factors controlling cardiac myosin-isoform shift during hypertrophy and heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43 (4), 388-403 (2007).
- Lapierre, H., Chan, V., Sohmer, B., Mesana, T. G., Ruel, M. Minimally invasive coronary artery bypass grafting via a small thoracotomy versus off-pump: A case-matched study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 804-810 (2011).
- Aubin, H., Akhyari, P., Lichtenberg, A., Albert, A. Additional right-sided upper "half-mini-thoracotomy" for aortocoronary bypass grafting during minimally invasive multivessel revascularization. Journal of Cardiothoracic Surgery. 10, 130 (2015).
- Hu, N., et al. Ligation of the left circumflex coronary artery with subsequent MRI and histopathology in rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (6), 838-844 (2010).
- Sievers, R. E., et al. A model of acute regional myocardial ischemia and reperfusion in the rat. Magnetic Resonance in Medicine. 10 (2), 172-181 (1989).
- Rodríguez, B., Trayanova, N., Noble, D. Modeling cardiac ischemia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1080, 395-414 (2006).
- Sinusas, A. J., et al. Quantification of area at risk during coronary occlusion and degree of myocardial salvage after reperfusion with technetium-99m methoxyisobutyl isonitrile. Circulation. 82 (4), 1424-1437 (1990).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Pombo, J. F., Troy, B. L., Russell, R. O. J. Left ventricular volumes and ejection fraction by echocardiography. Circulation. 43 (4), 480-490 (1971).
- McCully, J. D., Wakiyama, H., Hsieh, Y. J., Jones, M., Levitsky, S. Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), H1923-H1935 (2004).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 304 (7), 966-982 (2013).
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. Journal of Surgical Research. 162 (2), 239-249 (2010).
- Pirat, B., et al. A novel feature-tracking echocardiographic method for the quantitation of regional myocardial function: Validation in an animal model of ischemia-reperfusion. Journal of the American College of Cardiology. 51 (6), 651-659 (2008).
- Verdouw, P. D., vanden Doel, M. A., de Zeeuw, S., Duncker, D. J. Animal models in the study of myocardial ischaemia and ischaemic syndromes. Cardiovascular Research. 39 (1), 121-135 (1998).
- Bolukoglu, H., et al. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. The American Journal of Physiology. 263, H20-H29 (1992).
- Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J., Maroko, P. R., Vatner, S. F. Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. Journal of Clinical Investigation. 56 (4), 978-985 (1975).
