ウサギの虚血と再灌流障害のモデル
Summary
本研究は、生存症例の左ミニ開胸術または非生存症例の正中胸骨切開術を使用したウサギの急性局所心筋虚血および再灌流損傷の再現性の高い動物モデルを示しています。
Abstract
ここでのプロトコルは、非生存および生存実験のためにウサギに in situ 急性局所心筋虚血を誘発するためのシンプルで再現性の高い方法論を提供します。ニュージーランドホワイト成ウサギは、アトロピン、アセプロマジン、ブトルファノール、イソフルランで鎮静されています。動物は挿管され、人工呼吸器にかけられます。静脈内カテーテルを辺縁耳静脈に挿入し、薬を注入します。動物は、ヘパリン、リドカイン、および授乳中のリンゲル液で前薬を投与されます。頸動脈のカットダウンは、血圧モニタリングのための動脈ラインアクセスを得るために行われます。選択された生理学的および機械的パラメータは、継続的なリアルタイム分析によって監視および記録されます。
動物を鎮静させ、完全に麻酔をかけた状態で、4番目の肋間腔小左開胸術(生存)または正中胸骨切開術(非生存)のいずれかが行われます。心膜が開き、左前下行動脈(LAD)が位置します。
ポリプロピレン縫合糸をLAD動脈の2番目または3番目の斜め枝に通し、ポリプロピレンフィラメントを小さなビニールチューブに通してスネアを形成します。動物は、わなを締めることによってLADを閉塞することによって達成される、30分間の局所虚血にさらされます。心筋虚血は、心外膜の局所チアノーゼによって視覚的に確認されます。局所虚血に続いて、結紮糸が緩み、心臓が再灌流されます。
生存実験と非生存実験の両方で、心筋機能は、部分短縮の心エコー検査(ECHO)測定 によって 評価できます。非生存研究では、虚血領域内に埋め込まれた3つのデジタル圧電超音波プローブを使用して収集されたソノミクロメトリーからのデータと、先端に挿入された左心室(LV)カテーテルを使用した左心室発生圧力(LVDP)を継続的に取得して、それぞれ局所および全体的な心筋機能を評価することができます。
生存試験では、切開を閉じ、胸膜空気を排出するために左針開胸穿刺を行い、術後の疼痛管理を行います。
Introduction
心血管疾患は世界の主要な死因であり、毎年1,800万人以上が死亡しています1,2,3。急性心筋梗塞(MI)は、血栓またはアテローム性プラークの一部が冠状動脈の血流を遮断するときに発症する一般的な医療緊急事態です。これは、動脈が灌流する領域に局所心筋虚血を引き起こします。
本研究では、非生存および生存実験のためのウサギモデルでin situ急性局所心筋虚血を作成するために、シンプルで信頼性の高い方法論を利用するプロトコルについて説明します。この方法の最初の目標は、ミトコンドリア移植が心筋壊死の調節と虚血イベント後の虚血後の心機能の増加に及ぼす影響を評価することでした。これまでの研究では、虚血の発症と酸素供給の減少に続いて、ミトコンドリアの変化と高エネルギーリン酸レベルの急激な低下が発生し、心臓のエネルギー貯蔵が劇的に減少することが実証されています4。研究者は、薬理学的介入および/または処置技術を使用して虚血後の機能を改善し、心筋組織壊死を軽減しようとしましたが、これらの技術は限られた心臓保護を提供し、ミトコンドリアの損傷と機能障害への影響を最小限に抑えます5,6,7。私たちのチームや他のチームは、ミトコンドリアの損傷が主に虚血中に発生し、再灌流中のミトコンドリア呼吸機能の維持により、収縮回復が促進され、心筋梗塞のサイズが減少する可能性があることを以前に示しました8,9,10。したがって、再灌流前に虚血の影響を受けていない組織から虚血領域へのミトコンドリア移植は、心筋壊死を減らし、心筋機能を高めるための代替アプローチを提供するという仮説を立てました。ここでは、この理論をテストするために使用されたプロトコルと、最初の研究分析から得られた代表的な結果について詳しく説明します。
さらに、何人かの研究者は、心筋虚血再灌流障害の影響を定義し、適切な治療的介入を確立するために不可欠な他のトピックに焦点を当てています。そのような研究分野の1つがプレコンディショニングです。心筋虚血性プレコンディショニングは、短時間の虚血性ストレスによって活性化される心臓保護メカニズムであり、その後の長期虚血のエピソード中に心臓細胞壊死率を低下させます。これらのメカニズムは、低酸素症または冠状動脈閉塞のいずれかによって活性化される可能性があります。Mandelらは、低酸素-高酸素性プレコンディショニングが一酸化窒素代謝物のバランスを維持し、エンドセリン-1の過剰産生を減少させ、臓器保護をサポートすることを実証しました11。さらに、遠隔虚血性プレコンディショニングの概念、つまり単一臓器のプレコンディショニングが全身保護を提供する現象が探求されています。Aliらは、選択的開放腹部大動脈瘤修復術を受けている患者において、総腸骨動脈を断続的にクロスクランプして刺激する遠隔プレコンディショニングが、術後の心筋損傷、心筋梗塞、および腎障害の発生率を低下させることを発見しました12。
ウサギモデルは、他の種のモデルよりも潜在的な利点を提供し、不整脈の誘発、全体的および地域的な虚血モデル、心臓収縮の研究など、何十年にもわたって複数の異なるシナリオで使用されてきました13,14,15。ウサギの心臓は犬や豚の心臓よりも小さいですが、はるかに低コストで外科的処置を簡単に行うのに十分な大きさです13。ウサギの心臓は、人間の心臓によく似ているため、よく使用されます。実際、代謝率は同様で、β-ミオシン重鎖を発現し、重要な心筋キサンチンオキシダーゼを欠いています16。局所心筋虚血を誘導するために本明細書に記載の技術は、単純で、再現性があり、かつ費用対効果が高い。この方法では、全体的な虚血ではなく局所虚血のみが誘発され、必要な材料が特殊化されていないため、非生存と生存の両方の症例が可能になります。2つの異なる外科的アプローチ(すなわち、胸骨切開術とミニ開胸術)を利用することができるため、オペレーターと実験プロトコルは研究デザインの面でより自由度が高まります。さらに、この手順では、心肺バイパスを使用する必要はありません。これに関連して、冠動脈バイパス移植への低侵襲アプローチは、多血管血行再建術を必要とする患者にとって貴重な選択肢となっています17,18。このモデルは、これらのアプローチの違いを研究し、外科研修生に動物ベースの学習ツールを提供するために使用できます。さらに、このモデルを利用して心臓カテーテル検査を行うことは、生理学的研究および/または外科的トレーニングに役立つ可能性があります。
私たちのモデルは、局所心筋虚血を誘発し、その後、梗塞のサイズ、心筋機能、および細胞の変化を測定することが重要なアプリケーションの方法論を提供します。このプロトコルでは、細胞小器官の内在化、酸素消費、高エネルギーリン酸合成、サイトカインメディエーターとプロテオミクス経路の誘導を調べることにより、細胞機能と虚血への適応、および提案された治療介入(すなわち、ミトコンドリア移植)のいくつかのマーカーを評価することができました。これらの結果は、心筋のエネルギー、細胞生存率、および心機能を維持する上で重要であり、虚血再灌流損傷後の心臓保護技術の客観的な評価を可能にします。このモデルは、虚血後の心筋病理学と回復の分野で同様の生物学的経路と代替を研究するために使用できます。
このプロトコルの目的は、非生存および生存実験のためにウサギにin situ急性局所心筋虚血を誘発するための再現性の高い方法論を提供することです。このモデルは、生存率が高く、術中死亡率が低く、罹患率が最小の方法論を提供します19。急性局所心筋虚血の他のモデルは、放射性標識材料、造影剤、磁気共鳴画像法、またはコンピューターシミュレーションを使用して説明されています20,21,22。私たちのプロトコルは、費用対効果が高く、一貫して再現性があり、技術的要求が低いため、外科の専門知識がなくても研究者が実行できる、信頼性が高くシンプルな方法論を提供します。このプロトコルは、左ミニ開胸術を使用した生存プロジェクトまたは正中線胸骨切開術を使用した非生存モデルのいずれかに対応します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちのプロトコルは、ウサギの急性局所心筋虚血を行うための信頼できる方法論を示しています。左ミニ開胸術のアプローチは、切開とそれに伴う痛みを最小限に抑えなければならない生存症例に最適です。重要なことに、抜管前に利尿療法は必要ではなく、非生存群では術中死亡率、生存群では術後4週間での死亡率はなかった。プロトコルの設計で非生存症例が必要な場合、または全体…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルが使用された最初の研究は、National Heart, Lung, and Blood Institute Grants HL-103642 および HL-088206 によってサポートされました
Materials
| #10 blade | Bard Parker | 371210 | |
| #11 blade | Fisher Scientific | B3L | |
| 22 G PIV needle | BD Insyte | 381423 | |
| Acepromazine | VETONE | NDC 13985-587-50 | 0.5 mg/kg IM and IV |
| Aline pressure bag | Infu-Stat | 2139 | |
| Angiocath | Becton Dickinson | 382512 | |
| Arterial Catheter | Teleflex | MC-004912 | |
| Atropine | Hikma Pharmaceuticals | NDC 0641-6006-01 | 0.01 mg/kg IM |
| Betadine and 70% isopropyl alcohol | McKesson | NDC 68599-2302-6 | |
| Blood gas machine | Siemens | MRK0025 | |
| Bovie | Valleylab | E6008 | |
| Bulldog clamps | World Precision Instruments | 14119 | |
| Bupivacaine | Auromedics | NDC 55150-249-50 | 3 mg/kg IM |
| Butorphanol | Roxane | NDC 2054-3090-36 | 0.5 mg/kg IM |
| Clear acetate sheet | Oxford Instruments | ID 51-1625-0213 | |
| Clipers | Andis | AGC2 | |
| DeBakey forceps | Integra | P6280 | |
| Echocardiography machine | Philips | IE33 F1 | |
| Electrocardiography machine | Meditech | MD908B | |
| Endotracheal tube | Medline | #922774 | |
| Fentanyl | West-Ward | NDC 0641-6030-01 | 1–4 µg/kg transdermal patch |
| Formaldehyde solution 10% | Epredia | 94001 | |
| Glass plates | United Scientific | B01MUHX6MR | |
| Heparin Sodium | Sagent | NDC 69-0058-02 | 1000U in 1 mL 3 mg/kg |
| Hot water blanket | 3M | 55577 | |
| Isoflurane | Penn Veterinary Supply, INC | NDC 50989-606-15 | 1%–3% |
| Ketamine | Dechra | NDC 42023-138-10 | 10 mg/kg IV |
| Lab Chart 7 Acquisition Software | Adinstruments | ||
| Lactated Ringer's solution | ICUmedical | NDC 0990-7953-09 | 10 mL/kg/h |
| Laryngoscope | Welch Allyn | 68044 | |
| Left ventricule lumen catheter 3Fr | McKesson | 385764-EA | |
| Lidocaine (1%) | Pfizer | 4276-01 | 1–1.5 mL/kg IV |
| LVDP transducer | Edward | PDP-ED | |
| Marking pen | Viscot | 1451SR-100 Unsterile | |
| Mayo scissors | Mayo | S7-1098 | |
| Medetomidine | Entireoly Pets Pharmacy | NDC 015914-005-01 | 0.25 mg/kg IM |
| Metzenbaum scissors | Cole-Parmer | UX-10821-05 | |
| Monastra. Blue pigment 98% | Chemsavers | MBTR1100G | |
| Monocryl 5-0 | Ethicon | Y463G | |
| Mosquito clamp | Shioda | 802N | |
| PDS 3-0 | Ethicon | 42312201 | |
| Piezoelectric sonomicrometry crystals | Sonometrics | Small 2mm round | |
| Plegets | DeRoyal | 32-363 | |
| Povuine Iodine Prep Solutions | Medline | MDS093940 | |
| Precision vaporized system face mask | Yuwell | B07PNH69BF | |
| Prolene 3-0 | Ethicon | 8665G | |
| Proline 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Pulse oximetry probe | Masimo | 9216-U | |
| Rib spreader | Medline | MDS5621025 | |
| S12 Pediatric Sector Probe | Phillips | 21380A | |
| Sonomicrometer | Sonometrics | BZ10123724 | |
| Sterile gauze | Medline | 3.00802E+13 | |
| Sterile towels | McKesson | MON 277860EA | |
| Sternal retractor | Medline | MDS5610321 | |
| Sutures for closure | J&J Dental | 8698G | |
| Telemetriy monitor | Meditech | MD908B | |
| Temperature probe | Omega | KHSS-116G-RSC-12 | |
| Triphenyl tetrazolium chloride (1%) | Millipore | MFCD00011963 | |
| Ventilator | MedGroup | MSLGA 11 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | V635H | |
| Vinyl tubing | ABE | DISW 3001 |
References
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