열 블록을 사용한 동물성 플랑크톤에 대한 열 한계 결정
Summary
본 프로토콜은 안정하고 선형적인 열 구배를 생성하기 위해 상업적으로 이용가능한 성분의 사용을 예시한다. 이러한 구배는 플랑크톤 유기체, 특히 무척추 동물 유충의 열 상한을 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
열 한계와 폭은 종 분포를 예측하는 데 널리 사용되었습니다. 지구 온도가 계속 상승함에 따라 순응에 따라 열 한계가 어떻게 변하고 생활 단계와 개체군간에 어떻게 변하는 지 이해하는 것이 미래의 온난화에 대한 종의 취약성을 결정하는 데 중요합니다. 대부분의 해양 생물은 초기 플랑크톤 단계를 포함하는 복잡한 수명주기를 가지고 있습니다. 이러한 작은 초기 발달 단계(수십 미크론에서 수백 미크론)의 열 한계를 정량화하면 발달 병목 현상을 식별하는 데 도움이 되지만 이 프로세스는 표적 유기체의 작은 크기, 큰 벤치 공간 요구 사항 및 높은 초기 제조 비용으로 인해 어려울 수 있습니다. 여기에서는 소량(mL에서 수십 mL)에 맞춰진 설정이 제시됩니다. 이 설정은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 결합하여 안정적이고 선형적인 열 구배를 생성합니다. 설정의 생산 사양과 살아있는 개체와 죽은 개체를 소개 및 열거하고 치사 온도를 계산하는 절차도 제공됩니다.
Introduction
열 내성은 유기체의 생존과 기능의 핵심입니다 1,2. 인위적인 탄소 배출로 인해 지구가 계속 따뜻해짐에 따라 열 한계의 결정 및 적용에 대한 관심이 높아지고 있습니다3. 사망률, 발달 실패 및 이동성 상실과 같은 다양한 종말점이열 상한 및 하한을 결정하는 데 사용되었습니다4. 이러한 열 한계는 종종 유기체의 열 틈새에 대한 대리인으로 간주됩니다. 이 정보는 지구 온난화에 더 취약한 종을 식별하고 미래의 종 분포와 그에 따른 종 상호 작용을 예측하는 데 사용됩니다 3,5,6,7. 그러나 특히 작은 플랑크톤 유기체의 경우 열 한계를 결정하는 것은 어려울 수 있습니다.
플랑크톤 유기체, 특히 해양 무척추 동물의 애벌레 단계의 경우 열 한계는 만성 노출을 통해 결정될 수 있습니다. 만성 노출은 며칠에서 몇 주에 걸쳐 여러 온도에서 유충을 사육하고 유충 생존율 및/또는 발달률이 감소하는 온도를 결정함으로써 달성됩니다 8,9,10. 그러나 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 대규모 인큐베이터와 유충 사육 경험이 필요합니다(해양 무척추 동물 유충 배양에 대한 좋은 소개는 참조11 참조).
또는 열 응력에 대한 급성 노출을 사용하여 열 한계를 결정할 수 있습니다. 종종, 이러한 결정 접근법은 온도 제어 건조 수조(12,13,14)에 유충이 있는 작은 바이알을 배치하거나, PCR 열 순환기(15,16)에서 열 구배 기능을 활용하거나, 바이알이 꼭 맞는 구멍(17)을 갖는 큰 알루미늄 블록의 단부에 가열 및 냉각을 적용하여 생성된 열 구배를 따라 유리 바이알/미세 원심분리 튜브를 배치하는 것을 포함하고, 18,19. 일반적인 건식 수조는 단일 온도를 생성합니다. 따라서 온도 범위에서 성능을 평가하기 위해 여러 장치를 동시에 작동해야 합니다. 열 순환기는 그래디언트를 생성하지만 작은 시료량(120μL)만 수용하므로 신중한 조작이 필요합니다. 열 순환기와 유사하게 대형 알루미늄 블록은 선형적이고 안정적인 온도 구배를 생성합니다. 두 접근법 모두 로지스틱 또는 프로빗 회귀와 결합하여 인구의 50%(LT50)12,20,21에 대한 치사 온도를 계산할 수 있습니다. 그러나 사용 된 알루미늄 블록의 길이는 ~ 100cm였습니다. 이 크기에는 넓은 실험실 공간과 구멍을 뚫기 위한 특수 컴퓨터 수치 제어 밀링 머신에 대한 액세스가 필요합니다. 목표 온도를 유지하기 위해 두 개의 연구 등급 수조를 사용하는 것과 함께 설정 조립에 드는 재정적 비용이 높습니다.
따라서이 작업은 상업적으로 이용 가능한 부품으로 안정적이고 선형적인 온도 구배를 생성하는 대체 수단을 개발하는 것을 목표로합니다. 이러한 제품은 설치 공간이 작아야하며 플랑크톤 유기체에 대한 급성 열 응력 노출 실험에 쉽게 사용할 수 있어야합니다. 이 프로토콜은 크기가 <1mm인 동물성 플랑크톤을 표적 유기체로 사용하여 개발되었으므로 1.5mL 또는 2mL 미세 원심분리 튜브의 사용에 최적화되었습니다. 더 큰 연구 유기체에는 사용되는 1.5mL 미세 원심분리 튜브보다 큰 용기와 알루미늄 블록의 확장된 구멍이 필요합니다.
실험 장치를보다 쉽게 이용할 수있게하는 것 외에도이 작업은 데이터 처리 파이프 라인을 단순화하는 것을 목표로합니다. 상용 통계 소프트웨어는 로지스틱 또는 프로빗 회귀를 사용하여 LT50 을 계산하는 루틴을 제공하지만 라이선스 비용은 적지 않습니다. 따라서 오픈 소스 통계 프로그램 R22 에 의존하는 사용하기 쉬운 스크립트는 데이터 분석을보다 쉽게 이용할 수있게합니다.
이 프로토콜은 시판되는 부품으로 소형 열 블록을 제조하고 동물성 플랑크톤(모래 달러 Dendraster excentricus의 유충)을 급성 열 스트레스에 노출시켜 열 상한을 결정하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 급성 열 노출을 통해 작은 플랑크톤 유기체의 열 한계를 결정하는 접근 가능하고 사용자 정의 가능한 접근 방식을 제공합니다. 하단의 수조와 상단의 히터에 의해 제어되는 10홀 설계와 유연한 온도 엔드포인트를 통해 LT50을 정밀하게 결정할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용하면 <1°C의 열 한계 차이를 감지할 수 있습니다(그림 3). 이 접근법은 다양한…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Swarthmore College [KC]의 교수 연구 기금과 BJ를위한 Robert Reynolds and Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
