ヒートブロックを用いた動物プランクトンの熱限界決定
Summary
本プロトコルは、安定かつ直線的な温度勾配を生成するための市販のコンポーネントの使用を示す。このような勾配は、次に、プランクトン生物、特に無脊椎動物の幼虫の上限熱限界を決定するために使用できます。
Abstract
熱限界と幅は、種の分布を予測するために広く使用されてきました。地球の気温が上昇し続ける中、熱限界が順応によってどのように変化するか、そしてそれがライフステージと個体群の間でどのように変化するかを理解することは、将来の温暖化に対する種の脆弱性を決定するために不可欠です。ほとんどの海洋生物は、初期の浮遊段階を含む複雑なライフサイクルを持っています。これらの小さな初期発生段階(数十〜数百ミクロン)の熱限界を定量化することは、発生のボトルネックを特定するのに役立ちますが、このプロセスは、標的生物のサイズが小さく、ベンチスペースの要件が大きく、初期製造コストが高いため、困難な場合があります。ここでは、少量(mLから数十mL)を対象としたセットアップを紹介します。このセットアップは、市販のコンポーネントを組み合わせて、安定した線形温度勾配を生成します。セットアップの生産仕様、および生きている個体と死亡した個体を導入および列挙し、致死温度を計算する手順も提示されます。
Introduction
熱耐性は、生物の生存と機能の鍵です1,2。人為的な炭素排出により地球が温暖化し続けるにつれて、熱限界の決定と適用にますます注意が払われています3。死亡率、発達障害、移動性の喪失などのさまざまなエンドポイントを使用して、熱限界の上限と下限の両方を決定してきました4。これらの熱限界は、生物の熱的ニッチの代理と見なされることがよくあります。この情報は、地球温暖化に対してより脆弱な種を特定し、将来の種の分布と結果として生じる種の相互作用を予測するために使用されます3,5,6,7。ただし、特に小さなプランクトン生物の場合、熱限界を決定することは困難な場合があります。
浮遊生物、特に海洋無脊椎動物の幼虫期の場合、熱限界は慢性暴露によって決定することができます。慢性曝露は、幼虫を数日から数週間にわたっていくつかの温度で飼育し、幼虫の生存率および/または発育率が8,9,10を低下させる温度を決定することによって達成されます。ただし、このアプローチはかなり時間がかかり、大型のインキュベーターと幼虫飼育の経験が必要です(海洋無脊椎動物の幼虫の養殖に関する優れた紹介については、参考文献11を参照してください)。
あるいは、熱応力への急性暴露を使用して熱限界を決定することもできます。多くの場合、この決定アプローチは、幼虫を含む小さなバイアルを温度制御されたドライバス12,13,14に入れ、PCRサーマルサイクラー15,16の温度勾配機能を活用するか、バイアルがぴったりと収まる穴のある大きなアルミニウムブロックの端部に加熱および冷却を適用することによって生成された温度勾配に沿ってガラスバイアル/マイクロ遠心管を配置することを含む17、18,19。典型的なドライバスは単一の温度を生成します。したがって、複数のユニットを同時に操作して、温度範囲での性能を評価する必要があります。サーマルサイクラーはグラジエントを生成しますが、少量のサンプル(120 μL)にしか対応できず、慎重な操作が必要です。サーマルサイクラーと同様に、大きなアルミニウムブロックは線形で安定した温度勾配を作り出します。どちらのアプローチも、ロジスティック回帰またはプロビット回帰と組み合わせて、人口の50%の致死温度を計算することができます(LT50)12、20、21。ただし、使用されたアルミニウムブロックの長さは~100 cmでした。このサイズでは、広いラボスペースと、穴を開けるための特殊なコンピューター数値制御フライス盤へのアクセスが必要です。目標温度を維持するために2つの研究グレードの水浴を使用することとともに、セットアップを組み立てるための経済的コストは高くなります。
したがって、この研究は、市販の部品を使用して安定した線形温度勾配を生成するための代替手段を開発することを目的としています。このような製品は、設置面積が小さく、浮遊生物の急性熱応力暴露実験に簡単に使用できる必要があります。このプロトコルは、<1mmの大きさの動物プランクトンを標的生物として開発されたため、1.5mLまたは2mLの微量遠心チューブの使用に最適化されています。より大きな研究生物は、使用する1.5mLの微量遠心チューブよりも大きな容器と、アルミニウムブロックの拡大された穴を必要とします。
この作業は、実験装置をよりアクセスしやすくすることに加えて、データ処理パイプラインを簡素化することを目的としています。市販の統計ソフトウェアは、ロジスティック回帰またはプロビット回帰を使用してLT50 を計算するルーチンを提供しますが、ライセンスコストは重要ではありません。したがって、オープンソースの統計プログラムR22 に依存する使いやすいスクリプトは、データ分析をよりアクセスしやすくするであろう。
このプロトコルは、市販の部品でコンパクトなヒートブロックを製造し、動物プランクトン(サンドダラー デンドラスタエキセントリカスの幼虫)を急性熱ストレスにさらして熱の上限を決定する方法を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、急性熱曝露を通じて小さなプランクトン生物の熱限界を決定するためのアクセス可能でカスタマイズ可能なアプローチを提供します。下端の水浴と上端のヒーターによって制御される10穴設計と柔軟な温度エンドポイントにより、LT50を正確に決定できます。この方法を使用すると、<1°Cの熱限界の差を検出することができました(図3)。このア…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スワースモア大学[KC]の教員研究基金とBJのロバートレイノルズとルシンダルイス’70サマーリサーチフェローシップによってサポートされています。
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
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