Determinazione dei limiti termici per lo zooplancton utilizzando un blocco termico
Summary
Il presente protocollo illustra l’uso di componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Tale gradiente può quindi essere utilizzato per determinare il limite termico superiore degli organismi planctonici, in particolare delle larve di invertebrati.
Abstract
I limiti termici e l’ampiezza sono stati ampiamente utilizzati per prevedere la distribuzione delle specie. Mentre la temperatura globale continua a salire, capire come cambia il limite termico con l’acclimatazione e come varia tra le fasi della vita e le popolazioni è vitale per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. La maggior parte degli organismi marini ha cicli di vita complessi che includono i primi stadi planctonici. Mentre quantificare il limite termico di questi piccoli stadi iniziali di sviluppo (da decine a centinaia di micron) aiuta a identificare i colli di bottiglia dello sviluppo, questo processo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni degli organismi bersaglio, del grande spazio richiesto al banco e degli elevati costi iniziali di fabbricazione. Qui viene presentata una configurazione orientata verso piccoli volumi (da ml a decine di ml). Questa configurazione combina componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Vengono inoltre presentate le specifiche di produzione della configurazione, nonché le procedure per introdurre ed enumerare individui vivi rispetto a quelli morti e calcolare la temperatura letale.
Introduction
La tolleranza termica è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione degli organismi 1,2. Mentre il pianeta continua a riscaldarsi a causa delle emissioni antropogeniche di carbonio, viene prestata crescente attenzione alla determinazione e all’applicazione dei limiti termici3. Vari endpoint, come la mortalità, il mancato sviluppo e la perdita di mobilità, sono stati utilizzati per determinare i limiti termici superiori e inferiori4. Questi limiti termici sono spesso considerati un proxy per la nicchia termica di un organismo. Queste informazioni vengono a loro volta utilizzate per identificare le specie più vulnerabili al riscaldamento globale, nonché per prevedere la distribuzione futura delle specie e le interazioni delle specie risultanti 3,5,6,7. Tuttavia, determinare i limiti termici, specialmente per i piccoli organismi planctonici, può essere difficile.
Per gli organismi planctonici, in particolare gli stadi larvali degli invertebrati marini, il limite termico può essere determinato attraverso l’esposizione cronica. L’esposizione cronica si ottiene allevando larve a diverse temperature per giorni o settimane e determinando la temperatura alla quale la sopravvivenza larvale e/o il tasso di sviluppo si riduconodi 8,9,10. Tuttavia, questo approccio richiede piuttosto tempo e richiede grandi incubatori ed esperienza nell’allevamento delle larve (vedi riferimento11 per una buona introduzione alla coltura di larve di invertebrati marini).
In alternativa, l’esposizione acuta allo stress termico può essere utilizzata per determinare i limiti termici. Spesso, questo approccio di determinazione comporta il posizionamento di piccole fiale con larve in bagni asciutti a temperatura controllata 12,13,14, sfruttando le funzioni di gradiente termico nei termociclatori PCR 15,16, o mettendo fiale di vetro / tubi di microcentrifuga lungo un gradiente termico generato dal riscaldamento e raffreddamento applicati alle estremità di grandi blocchi di alluminio con fori in cui le fiale si adattano perfettamente 17, 18,19. I tipici bagni secchi generano una singola temperatura; Pertanto, è necessario utilizzare più unità contemporaneamente per valutare le prestazioni in un intervallo di temperature. I termociclatori generano un gradiente, ma possono contenere solo un piccolo volume di campione (120 μL) e richiedono un’attenta manipolazione. Simile ai termociclatori, i grandi blocchi di alluminio creano gradienti di temperatura lineari e stabili. Entrambi gli approcci possono essere accoppiati con la regressione logistica o probit per calcolare la temperatura letale per il 50% della popolazione (LT50)12,20,21. Tuttavia, i blocchi di alluminio utilizzati erano lunghi ~ 100 cm; Questa dimensione richiede un ampio spazio di laboratorio e l’accesso a fresatrici a controllo numerico computerizzate specializzate per praticare i fori. Insieme all’utilizzo di due bagni d’acqua di livello di ricerca per mantenere la temperatura target, il costo finanziario dell’assemblaggio della configurazione è elevato.
Pertanto, questo lavoro mira a sviluppare un mezzo alternativo per generare un gradiente di temperatura stabile e lineare con parti disponibili in commercio. Tale prodotto deve avere un ingombro ridotto e deve poter essere facilmente utilizzato per esperimenti di esposizione acuta allo stress termico per organismi planctonici. Questo protocollo è sviluppato con zooplancton di dimensioni <1 mm come organismi bersaglio e, quindi, è stato ottimizzato per l'uso di una provetta da microcentrifuga da 1,5 o 2 ml. Gli organismi di studio più grandi richiederanno contenitori più grandi delle provette di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzate e fori allargati nei blocchi di alluminio.
Oltre a rendere più accessibile l’apparato sperimentale, questo lavoro mira a semplificare la pipeline di elaborazione dei dati. Mentre il software statistico commerciale fornisce routine per calcolare LT50 utilizzando la regressione logistica o probit, il costo della licenza non è banale. Pertanto, uno script facile da usare che si basa sul programma statistico open source R22 renderebbe l’analisi dei dati più accessibile.
Questo protocollo mostra come un blocco termico compatto può essere fabbricato con parti disponibili in commercio ed essere applicato per esporre lo zooplancton (larve del dollaro di sabbia Dendraster excentricus) allo stress termico acuto per determinare il loro limite termico superiore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce un approccio accessibile e personalizzabile per determinare i limiti termici di piccoli organismi plancton attraverso l’esposizione termica acuta. Il design a 10 fori e i punti finali di temperatura flessibili, controllati dal bagno d’acqua all’estremità inferiore e dal riscaldatore all’estremità superiore, consentono di determinare LT50 con precisione. Utilizzando questo approccio, è stata rilevata una differenza nel limite termico di <1 °C (Figura 3</strong…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal Faculty Research Fund dello Swarthmore College [KC] e dalla Robert Reynolds and Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship per BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
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