يبحث هذا البروتوكول في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض البالمتيك.
يتزايد حدوث مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) بمعدل ينذر بالخطر في جميع أنحاء العالم. يستخدم Platycodon grandiflorum على نطاق واسع كطب عرقي تقليدي لعلاج الأمراض المختلفة وهو غذاء وظيفي نموذجي يمكن دمجه في النظام الغذائي اليومي. أشارت الدراسات إلى أن platycodin D (PD) ، أحد المكونات النشطة الرئيسية في Platycodon grandiflorum ، لديه توافر بيولوجي مرتفع ويخفف بشكل كبير من تقدم NAFLD ، لكن الآلية الأساسية لذلك لا تزال غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثير العلاجي لمرض باركنسون ضد NAFLD في المختبر. تمت معالجة خلايا AML-12 مسبقا بحمض البالمتيك 300 ميكرومتر (PA) لمدة 24 ساعة لنمذجة NAFLD في المختبر. بعد ذلك ، تم علاج الخلايا إما بمرض باركنسون أو لم تتلق أي علاج لمرض باركنسون لمدة 24 ساعة. تم تحليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين (DCFH-DA) ، وتم تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا بطريقة تلطيخ JC-1. علاوة على ذلك ، تم تحليل مستويات التعبير البروتيني ل LC3-II / LC3-I و p62 / SQSTM1 في محللات الخلية عن طريق النشاف الغربي. وجد أن PD يقلل بشكل كبير من مستويات إمكانات غشاء ROS والميتوكوندريا في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. وفي الوقت نفسه ، زاد PD من مستويات LC3-II / LC3-I وخفض مستويات p62 / SQSTM1 في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. أشارت النتائج إلى أن PD خفف من NAFLD في المختبر عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وتحفيز الالتهام الذاتي. هذا النموذج في المختبر هو أداة مفيدة لدراسة دور PD في NAFLD.
Platycodon grandiflorus (PG) ، وهو الجذر المجفف ل Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC ، يستخدم في الطب الصيني التقليدي (TCM). يتم إنتاجه بشكل رئيسي في المناطق الشمالية الشرقية والشمالية والشرقية والوسطى والجنوبية الغربية من الصين1. تشمل مكونات PG الصابونين ثلاثي التربينويد ، والسكريات ، والفلافونويد ، والبوليفينول ، والبولي إيثيلين جلايكول ، والزيوت المتطايرة ، والمعادن2. PG لها تاريخ طويل من استخدامها كغذاء ودواء عشبي في آسيا. تقليديا ، تم استخدام هذه العشبة لصنع الدواء ضد أمراض الرئة. يوفر علم الصيدلة الحديث أيضا دليلا على فعالية PG لعلاج الأمراض الأخرى. أظهرت الدراسات أن PG له تأثير علاجي على مجموعة متنوعة من نماذج إصابة الكبد التي يسببها الدواء. المكملات الغذائية من PG أو platycodin المستخلصات يمكن أن تخفف من السمنة التي يسببها النظام الغذائي عالي الدهون والأمراض الأيضية المرتبطة بها3،4،5. يمكن استخدام السكريات من PG لعلاج إصابة الكبد الحادة الناجمة عن LPS / D-GalN في الفئران6. علاوة على ذلك ، فإن الصابونين من جذور PG يحسن من التهاب الكبد الدهني غير الكحولي الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون (NASH)7. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعزز platycodin D (PD) ، أحد أهم المكونات العلاجية ل PG ، تعبير مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة وامتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة في خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HepG2)8. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحفز PD أيضا موت الخلايا المبرمج ويمنع الالتصاق والهجرة والغزو في خلايا HepG2 9,10. وهكذا ، في هذه الدراسة ، يتم استخدام خلايا الورم الكبدي AML-12 في الفأر لبناء نموذج في المختبر ولمزيد من الدراسة للتأثيرات الدوائية والآليات الأساسية لمرض باركنسون في هذا النموذج.
يشير مصطلح مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) إلى مجموعة من أمراض الكبد التي تشمل التنكس الدهني البسيط ، و NASH ، وتليف الكبد ، وسرطان الخلايا الكبدية11. على الرغم من أن التسبب في NAFLD غير مفهوم بشكل كامل ، من نظرية “الضربتين” الكلاسيكية إلى نظرية “الضربات المتعددة” الحالية ، تعتبر مقاومة الأنسولين مركزية في التسبب في NAFLD12،13،14. أظهرت الدراسات أن مقاومة الأنسولين في خلايا الكبد يمكن أن تؤدي إلى زيادة الأحماض الدهنية الحرة ، والتي تشكل الدهون الثلاثية التي تترسب في الكبد وتتسبب في أن يصبح الكبد دهنيا15,16. يمكن أن يؤدي تراكم الدهون إلى السمية الدهنية ، واختلال وظائف الميتوكوندريا الناجم عن الإجهاد التأكسدي ، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية ، وإطلاق السيتوكين الالتهابي ، مما يؤدي إلى التسبب في مرض وتطور NAFLD17,18. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب الالتهام الذاتي أيضا دورا في التسبب في NAFLD ، حيث يشارك في تنظيم حساسية الأنسولين الخلوي ، واستقلاب الدهون الخلوية ، وإصابة خلايا الكبد ، والمناعة الفطرية19،20،21.
تم إنشاء مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية والنماذج الخلوية لتوفير أساس لاستكشاف التسبب في المرض والأهداف العلاجية المحتملة ل NAFLD22,23. ومع ذلك ، لا يمكن للنماذج الحيوانية الفردية تقليد جميع العمليات المرضية ل NAFLD24 بشكل كامل. الاختلافات الفردية بين الحيوانات تؤدي إلى سمات مرضية مختلفة. يضمن استخدام خطوط خلايا الكبد أو خلايا الكبد الأولية في الدراسات المختبرية ل NAFLD أقصى قدر من الاتساق في الظروف التجريبية. يمكن أن يؤدي عدم تنظيم استقلاب الدهون الكبدية إلى مستويات أعلى من تراكم قطرات الدهون في خلايا الكبد في NAFLD25. تم استخدام الأحماض الدهنية الحرة مثل حمض الأوليك وزيت النخيل في النموذج في المختبر لتقليد NAFLD الناجم عن اتباع نظام غذائي غني بالدهون26,27. غالبا ما يستخدم خط خلايا الورم الأرومي الكبدي البشري HepG2 في بناء نماذج NAFLD في المختبر ، ولكن كخط خلية ورمية ، يختلف استقلاب خلايا HepG2 اختلافا كبيرا عن استقلاب خلايا الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية العادية28. لذلك ، فإن استخدام خلايا الكبد الأولية أو خلايا الكبد الأولية للفأر لبناء نموذج NAFLD في المختبر لفحص الأدوية أكثر فائدة من استخدام خطوط الخلايا السرطانية. بمقارنة الفحص التآزري لتأثيرات الأدوية والأهداف العلاجية في كل من النماذج الحيوانية ونماذج خلايا الكبد في المختبر ، يبدو أن استخدام خلايا الكبد الفأرية لبناء نموذج NAFLD في المختبر لديه إمكانات تطبيق أفضل.
تتأكسد الأحماض الدهنية الحرة التي تدخل الكبد لإنتاج الطاقة أو تخزن في صورة دهون ثلاثية. بشكل ملحوظ ، الأحماض الدهنية الحرة لها سمية دهنية معينة وقد تحفز الخلل الخلوي وموت الخلاياالمبرمج 12. حمض البالمتيك (PA) هو أكثر الأحماض الدهنية المشبعة وفرة في البلازما البشرية29. عندما تتعرض الخلايا في الأنسجة غير الدهنية لتركيزات عالية من PA لفترة طويلة ، فإن هذا يحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويسبب الإجهاد التأكسدي وتراكم الدهون وحتى موت الخلايا المبرمج30. لذلك ، يستخدم العديد من الباحثين PA كمحفز لتحفيز خلايا الكبد لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وبالتالي ، بناء نموذج مرض الكبد الدهني في المختبر وتقييم الآثار الوقائية لبعض المواد الفعالة على الخلايا31،32،33،34. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للتحقيق في الآثار الوقائية لمرض باركنسون على نموذج خلية من NAFLD الناجم عن السلطة الفلسطينية.
أبرزت الدراسات حقيقة أن NAFLD هي متلازمة سريرية مرضية ، تتراوح من الكبد الدهني إلى NASH ، والتي يمكن أن تتطور إلى تليف الكبد وسرطان الكبد51. يعد النظام الغذائي عالي الدهون ونمط الحياة غير النشط من عوامل الخطر النموذجية لمرض الكبد الدهني غير الكحولي. تم بحث كل من العلاجات غير الدوائ?…
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من خلال منح من لجنة تشونغتشينغ للعلوم والتكنولوجيا (cstc2020jxjl-jbky10002 و jbky20200026 و cstc2021jscx-dxwtBX0013 و jbky20210029) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2021MD703919).
5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |