Étude des effets protecteurs de la platycodine D sur la stéatose hépatique non alcoolique dans un modèle in vitro induit par l’acide palmitique

Summary

Ce protocole étudie les effets protecteurs de la platycodine D sur la stéatose hépatique non alcoolique dans un modèle in vitro induit par l’acide palmitique.

Abstract

L’apparition de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a augmenté à un rythme alarmant dans le monde entier. Platycodon grandiflorum est largement utilisé comme ethnomédecine traditionnelle pour le traitement de diverses maladies et est un aliment fonctionnel typique qui peut être incorporé dans l’alimentation quotidienne. Des études ont suggéré que la platycodine D (), l’un des principaux ingrédients actifs de Platycodon grandiflorum, a une biodisponibilité élevée et atténue considérablement la progression de la NAFLD, mais le mécanisme sous-jacent de ceci n’est pas encore clair. Cette étude vise à étudier l’effet thérapeutique de la MP contre la NAFLD in vitro. Les cellules AML-12 ont été prétraitées avec de l’acide palmitique (PA) 300 μM pendant 24 heures pour modéliser la NAFLD in vitro. Ensuite, les cellules ont été traitées avec la MP ou n’ont reçu aucun traitement de MP pendant 24 heures. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été analysés à l’aide d’une coloration au diacétate de 2′,7′-dichloro-dihydrofluorescéine (DCFH-DA), et le potentiel de membrane mitochondriale a été déterminé par la méthode de coloration JC-1. De plus, les niveaux d’expression protéique de LC3-II/LC3-I et p62/SQSTM1 dans les lysats cellulaires ont été analysés par transfert Western. La MP a permis de réduire de manière significative les niveaux de ROS et de potentiel de membrane mitochondriale dans le groupe traité par PA par rapport au groupe témoin. Pendant ce temps, la MP a augmenté les taux de LC3-II/LC3-I et diminué les taux de p62/SQSTM1 dans le groupe traité par PA par rapport au groupe témoin. Les résultats ont indiqué que la MP améliorait la NAFLD in vitro en réduisant le stress oxydatif et en stimulant l’autophagie. Ce modèle in vitro est un outil utile pour étudier le rôle de la MP dans la NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), qui est la racine séchée de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., est utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise (MTC). Il est principalement produit dans les régions du nord-est, du nord, de l’est, du centre et du sud-ouest de la Chine¹. Les composants PG comprennent les saponines triterpénoïdes, les polysaccharides, les flavonoïdes, les polyphénols, les polyéthylèneglycols, les huiles volatiles et les minéraux². PG a une longue histoire d’être utilisé comme un aliment et un médicament à base de plantes en Asie. Traditionnellement, cette plante était utilisée pour fabriquer des médicaments contre les maladies pulmonaires. La pharmacologie moderne fournit également des preuves de l’efficacité du PG pour le traitement d’autres maladies. Des études ont montré que PG a un effet thérapeutique sur une variété de modèles de lésions hépatiques induites par les médicaments. La supplémentation alimentaire en extraits de PG ou de platycodine peut améliorer l’obésité induite par un régime riche en graisses et ses maladies métaboliques connexes ^3,4,5. Les polysaccharides de PG peuvent être utilisés pour le traitement des lésions hépatiques aiguës causées par le LPS/D-GalN chez la souris⁶. De plus, les saponines des racines de PG améliorent la stéatohépatite non alcoolique induite par un régime riche en graisses (NASH)⁷. De plus, la platycodine D (), l’un des composants thérapeutiques les plus importants du PG, peut améliorer l’expression des récepteurs des lipoprotéines de basse densité et l’absorption des lipoprotéines de basse densité dans les cellules du carcinome hépatocellulaire humain (HepG2)⁸. De plus, la MP peut également induire l’apoptose et inhiber l’adhésion, la migration et l’invasion dans les cellules HepG2 ^9,10. Ainsi, dans cette étude, les cellules AML-12 de l’hépatome de souris sont utilisées pour la construction de modèles in vitro et pour étudier plus en détail les effets pharmacologiques et les mécanismes sous-jacents de la MP dans ce modèle.

Le terme stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) fait référence à un groupe de maladies du foie qui comprend la stéatose simple, la NASH, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire¹¹. Bien que la pathogenèse de la NAFLD ne soit pas complètement comprise, de la théorie classique des « deux coups » à la théorie actuelle des « coups multiples », la résistance à l’insuline est considérée comme centrale dans la pathogenèse de la NAFLD^12,13,14. Des études ont démontré que la résistance à l’insuline dans les hépatocytes pourrait entraîner une augmentation des acides gras libres, qui forment des triglycérides qui se déposent dans le foie et rendent le foie gras^15,16. L’accumulation de graisse peut entraîner une lipotoxicité, un dysfonctionnement mitochondrial induit par le stress oxydatif, un stress du réticulum endoplasmique et la libération de cytokines inflammatoires, entraînant la pathogenèse et la progression de NAFLD^17,18. En outre, l’autophagie joue également un rôle dans la pathogenèse de la NAFLD, car elle est impliquée dans la régulation de la sensibilité cellulaire à l’insuline, du métabolisme des lipides cellulaires, des lésions hépatocytes et de l’immunité innée 19,20,21.

Une variété de modèles animaux et de modèles cellulaires ont été établis pour fournir une base pour explorer la pathogenèse et les cibles thérapeutiques potentielles de NAFLD^22,23. Cependant, les modèles animaux uniques ne peuvent pas imiter complètement tous les processus pathologiques de NAFLD²⁴. Les différences individuelles entre les animaux conduisent à des caractéristiques pathologiques différentes. L’utilisation de lignées cellulaires hépatiques ou d’hépatocytes primaires dans les études in vitro de la NAFLD assure une cohérence maximale dans les conditions expérimentales. La dérégulation du métabolisme lipidique hépatique peut entraîner des niveaux plus élevés d’accumulation de gouttelettes lipidiques hépatocytes dans NAFLD²⁵. Les acides gras libres tels que l’acide oléique et l’huile de palme ont été utilisés dans le modèle in vitro pour imiter la NAFLD causée par un régime riche^{en graisses 26,27}. La lignée cellulaire d’hépatoblastome humain HepG2 est souvent utilisée in vitro dans la construction de modèles NAFLD, mais, en tant que lignée cellulaire tumorale, le métabolisme des cellules HepG2 est significativement différent de celui des cellules hépatiques dans des conditions physiologiques normales²⁸. Par conséquent, l’utilisation d’hépatocytes primaires ou d’hépatocytes primaires de souris pour construire le modèle NAFLD in vitro pour le dépistage de médicaments est plus avantageuse que l’utilisation de lignées cellulaires tumorales. En comparant l’examen synergique des effets des médicaments et des cibles thérapeutiques dans les modèles animaux et les modèles d’hépatocytes in vitro, il semble que l’utilisation d’hépatocytes de souris pour construire le modèle NAFLD in vitro ait un meilleur potentiel d’application.

Les acides gras libres qui pénètrent dans le foie sont oxydés pour produire de l’énergie ou stockés sous forme de triglycérides. De manière significative, les acides gras libres ont une certaine lipotoxicité et peuvent induire un dysfonctionnement cellulaire et l’apoptose¹². L’acide palmitique (PA) est l’acide gras saturé le plus abondant dans le plasma humain²⁹. Lorsque les cellules du tissu non adipeux sont exposées à des concentrations élevées de PA pendant une longue période, cela stimule la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et provoque un stress oxydatif, une accumulation de lipides et même une apoptose³⁰. Par conséquent, de nombreux chercheurs utilisent l’AP comme inducteur pour stimuler les cellules hépatiques à produire des ROS et, ainsi, construire le modèle in vitro de la stéatose hépatique et évaluer les effets protecteurs de certaines substances actives sur les cellules^31,32,33,34. Cette étude introduit un protocole pour étudier les effets protecteurs de la MP sur un modèle cellulaire de NAFLD induite par PA.

Protocol

Les cellules AML-12 (une lignée cellulaire d’hépatocytes de souris normale) sont utilisées pour les études cellulaires. Les cellules proviennent d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). 1. Prétraitement des cellules AML-12 pour modéliser la NAFLD in vitro Maintenir les cellules dans des milieux de culture cellulaire normaux (DMEM plus F12 de Ham [1:1] contenant 0,005 mg/mL d’insuline, 5 ng/mL de sélénium, 0,0…

Representative Results

ROS intracellulaires dans les cellulesLes cellules AML-12 ont été induites avec 300 μM PA pendant 24 h, et un modèle de cellules NAFLD a été établi. Par la suite, les cellules ont été traitées avec pendant 24 h. Les cellules ont été marquées avec une sonde fluorescente DCFH-DA, et la production de ROS a été observée au microscope à fluorescence. Les résultats de la coloration DCFH-DA des ROS intracellulaires dans les cellules sont présentés à la figure 1</str…

Discussion

Des études ont mis en évidence le fait que la NAFLD est un syndrome clinicopathologique, allant de la stéatose hépatique à la NASH, qui peut évoluer vers la cirrhose et le cancer du foie⁵¹. Un régime riche en graisses et un mode de vie inactif sont des facteurs de risque typiques de la NAFLD. Les thérapies non médicamenteuses et les thérapies médicamenteuses pour le traitement de la NAFLD ont fait l’objet de recherches^51,52,53…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004