Dit protocol onderzoekt de beschermende effecten van platycodine D op niet-alcoholische leververvetting in een palmitinezuur-geïnduceerd in vitro model.
Het voorkomen van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is wereldwijd in een alarmerend tempo toegenomen. Platycodon grandiflorum wordt veel gebruikt als een traditionele etnogeneeskunde voor de behandeling van verschillende ziekten en is een typisch functioneel voedsel dat kan worden opgenomen in het dagelijkse dieet. Studies hebben gesuggereerd dat platycodine D (PD), een van de belangrijkste actieve ingrediënten in Platycodon grandiflorum, een hoge biologische beschikbaarheid heeft en de voortgang van NAFLD aanzienlijk vermindert, maar het onderliggende mechanisme hiervan is nog steeds onduidelijk. Deze studie heeft tot doel het therapeutisch effect van PD tegen NAFLD in vitro te onderzoeken. AML-12-cellen werden gedurende 24 uur voorbehandeld met 300 μM palmitinezuur (PA) om NAFLD in vitro te modelleren. Vervolgens werden de cellen behandeld met PD of kregen ze gedurende 24 uur geen PD-behandeling. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) werden geanalyseerd met behulp van 2′,7′-dichloor-dihydro-fluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleuring en de mitochondriale membraanpotentiaal werd bepaald door de JC-1-kleuringsmethode. Bovendien werden de eiwitexpressieniveaus van LC3-II/LC3-I en p62/SQSTM1 in de cellysaten geanalyseerd door western blotting. PD bleek de ROS- en mitochondriale membraanpotentiaalniveaus in de met PA behandelde groep significant te verlagen in vergelijking met de controlegroep. Ondertussen verhoogde PD de LC3-II/LC3-I-niveaus en verlaagde de p62/SQSTM1-niveaus in de met PA behandelde groep in vergelijking met de controlegroep. De resultaten gaven aan dat PD NAFLD in vitro verbeterde door oxidatieve stress te verminderen en autofagie te stimuleren. Dit in vitro model is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van PD in NAFLD.
Platycodon grandiflorus (PG), de gedroogde wortel van Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., wordt gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM). Het wordt voornamelijk geproduceerd in de noordoostelijke, noordelijke, oostelijke, centrale en zuidwestelijke regio’s van China1. De PG-componenten omvatten triterpenoïde saponinen, polysacchariden, flavonoïden, polyfenolen, polyethyleenglycolen, vluchtige oliën en mineralen2. PG heeft een lange geschiedenis van gebruik als voedsel en kruidengeneesmiddel in Azië. Traditioneel werd dit kruid gebruikt om medicijnen tegen longziekten te maken. Moderne farmacologie levert ook bewijs van de werkzaamheid van PG voor de behandeling van andere ziekten. Studies hebben aangetoond dat PG een therapeutisch effect heeft op een verscheidenheid aan door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadigingsmodellen. De voedingssuppletie van PG- of platycodinextracten kan vetrijke door voeding veroorzaakte obesitas en de bijbehorende metabole ziekten verbeteren 3,4,5. Polysacchariden van PG kunnen worden gebruikt voor de behandeling van acute leverbeschadiging veroorzaakt door LPS / D-GalN bij muizen6. Bovendien verbeteren saponinen uit de wortels van PG vetrijke dieet-geïnduceerde niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)7. Bovendien kan platycodine D (PD), een van de belangrijkste therapeutische componenten van PG, de expressie van lipoproteïnereceptoren met lage dichtheid en de opname van lipoproteïne met lage dichtheid in cellen van menselijk hepatocellulair carcinoom (HepG2) verbeteren8. Bovendien kan PD ook apoptose induceren en adhesie, migratie en invasie in HepG2-cellen remmen 9,10. In deze studie worden muis hepatoom AML-12-cellen dus gebruikt voor in vitro modelconstructie en om de farmacologische effecten en onderliggende mechanismen van PD in dit model verder te bestuderen.
De term niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) verwijst naar een groep leverziekten die eenvoudige steatose, NASH, cirrose en hepatocellulair carcinoomomvat 11. Hoewel de pathogenese van NAFLD onvolledig wordt begrepen, van de klassieke “two-hit” theorie tot de huidige “multiple-hit” theorie, wordt insulineresistentie beschouwd als centraal in de pathogenese van NAFLD12,13,14. Studies hebben aangetoond dat insulineresistentie in hepatocyten kan leiden tot verhoogde vrije vetzuren, die triglyceriden vormen die in de lever worden afgezet en ervoor zorgen dat de lever vet wordt15,16. De ophoping van vet kan leiden tot lipotoxiciteit, oxidatieve stress-geïnduceerde mitochondriale disfunctie, endoplasmatische reticulumstress en inflammatoire cytokine-afgifte, resulterend in de pathogenese en progressie van NAFLD17,18. Bovendien speelt autofagie ook een rol bij de pathogenese van NAFLD, omdat het betrokken is bij het reguleren van cellulaire insulinegevoeligheid, cellulair lipidenmetabolisme, hepatocytenbeschadiging en aangeboren immuniteit 19,20,21.
Een verscheidenheid aan diermodellen en cellulaire modellen zijn vastgesteld om een basis te bieden voor het verkennen van de pathogenese en potentiële therapeutische doelen van NAFLD22,23. Afzonderlijke diermodellen kunnen echter niet alle pathologische processen van NAFLD24 volledig nabootsen. Individuele verschillen tussen dieren leiden tot verschillende pathologische kenmerken. Het gebruik van levercellijnen of primaire hepatocyten in in vitro studies van NAFLD zorgt voor maximale consistentie in de experimentele omstandigheden. Ontregeling van het lipidenmetabolisme in de lever kan leiden tot hogere niveaus van accumulatie van hepatocytenlipidedruppels in NAFLD25. Vrije vetzuren zoals oliezuur en palmolie zijn gebruikt in het in vitro model om NAFLD na te bootsen veroorzaakt door een vetrijk dieet26,27. De menselijke hepatoblastoomcellijn HepG2 wordt vaak gebruikt bij de constructie van NAFLD-modellen in vitro, maar als tumorcellijn verschilt het metabolisme van HepG2-cellen aanzienlijk van dat van levercellen onder normale fysiologische omstandigheden28. Daarom is het gebruik van primaire hepatocyten of primaire hepatocyten van muizen om het in vitro NAFLD-model voor geneesmiddelenscreening te construeren voordeliger dan het gebruik van tumorcellijnen. Bij vergelijking van het synergetisch onderzoek van geneesmiddeleffecten en therapeutische doelen in zowel diermodellen als in vitro hepatocytenmodellen, lijkt het erop dat het gebruik van muishepatocyten om het in vitro NAFLD-model te construeren een beter toepassingspotentieel heeft.
Vrije vetzuren die de lever binnenkomen, worden geoxideerd om energie te produceren of opgeslagen als triglyceriden. Significant is dat vrije vetzuren een bepaalde lipotoxiciteit hebben en cellulaire disfunctie en apoptose kunnen veroorzaken12. Palmitinezuur (PA) is het meest voorkomende verzadigde vetzuur in menselijk plasma29. Wanneer cellen in niet-vetweefsel lange tijd worden blootgesteld aan hoge concentraties PA, stimuleert dit de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en veroorzaakt oxidatieve stress, lipideaccumulatie en zelfs apoptose30. Daarom gebruiken veel onderzoekers PA als een inductor om levercellen te stimuleren om ROS te produceren en zo het in vitro leververvettingsmodel te construeren en de beschermende effecten van bepaalde werkzame stoffen op cellen te evalueren31,32,33,34. Deze studie introduceert een protocol voor het onderzoeken van de beschermende effecten van PD op een celmodel van NAFLD geïnduceerd door PA.
Studies hebben het feit benadrukt dat NAFLD een clinicopathologisch syndroom is, variërend van leververvetting tot NASH, dat zich kan ontwikkelen tot cirrose en leverkanker51. Een vetrijk dieet en een inactieve levensstijl zijn typische risicofactoren voor NAFLD. Zowel niet-medicamenteuze therapieën als medicamenteuze therapieën voor NAFLD-behandeling zijn onderzocht51,52,53. De pathogenese van NAFLD i…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 en jbky20210029) en de China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703919).
5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |