Studio degli effetti protettivi del platicodina D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto da acido palmitico

Summary

Questo protocollo studia gli effetti protettivi della platycodin D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto dall’acido palmitico.

Abstract

L’incidenza della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è aumentata a un ritmo allarmante in tutto il mondo. Platycodon grandiflorum è ampiamente usato come etnomedicina tradizionale per il trattamento di varie malattie ed è un tipico alimento funzionale che può essere incorporato nella dieta quotidiana. Gli studi hanno suggerito che il platycodin D (PD), uno dei principali ingredienti attivi di Platycodon grandiflorum, ha un’elevata biodisponibilità e mitiga significativamente il progresso della NAFLD, ma il meccanismo sottostante di questo non è ancora chiaro. Questo studio mira a studiare l’effetto terapeutico del PD contro la NAFLD in vitro. Le cellule AML-12 sono state pretrattate con acido palmitico (PA) da 300 μM per 24 ore per modellare la NAFLD in vitro. Quindi, le cellule sono state trattate con PD o non hanno ricevuto alcun trattamento PD per 24 ore. I livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono stati analizzati utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) e il potenziale della membrana mitocondriale è stato determinato dal metodo di colorazione JC-1. Inoltre, i livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nei lisati cellulari sono stati analizzati mediante western blotting. È stato riscontrato che il PD riduce significativamente i livelli di ROS e di potenziale della membrana mitocondriale nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. Nel frattempo, il PD ha aumentato i livelli di LC3-II / LC3-I e diminuito i livelli di p62 / SQSTM1 nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. I risultati hanno indicato che il PD ha migliorato la NAFLD in vitro riducendo lo stress ossidativo e stimolando l’autofagia. Questo modello in vitro è uno strumento utile per studiare il ruolo del PD nella NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), che è la radice essiccata di Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., è usato nella medicina tradizionale cinese (MTC). Viene prodotto principalmente nelle regioni nord-est, nord, est, centro e sud-ovest della Cina¹. I componenti PG includono saponine triterpenoidi, polisaccaridi, flavonoidi, polifenoli, glicoli polietilenico, oli volatili e minerali². PG ha una lunga storia di essere usato come alimento e una medicina a base di erbe in Asia. Tradizionalmente, questa erba è stata usata per fare medicina contro le malattie polmonari. La farmacologia moderna fornisce anche prove dell’efficacia della PG per il trattamento di altre malattie. Gli studi hanno dimostrato che PG ha un effetto terapeutico su una varietà di modelli di danno epatico indotti da farmaci. L’integrazione alimentare di estratti di PG o platycodin può migliorare l’obesità indotta dalla dieta ricca di grassi e le sue malattie metaboliche correlate ^3,4,5. I polisaccaridi da PG possono essere utilizzati per il trattamento del danno epatico acuto causato da LPS/D-GalN nei topi⁶. Inoltre, le saponine dalle radici di PG migliorano la steatoepatite non alcolica (NASH) indotta dalla dieta ricca di ^grassi7. Inoltre, la platycodin D (PD), uno dei componenti terapeutici più importanti della PG, può migliorare l’espressione del recettore delle lipoproteine a bassa densità e l’assorbimento delle lipoproteine a bassa densità nelle cellule del carcinoma epatocellulare umano (HepG2)⁸. Inoltre, il PD può anche indurre apoptosi e inibire l’adesione, la migrazione e l’invasione nelle cellule HepG2 ^9,10. Pertanto, in questo studio, le cellule AML-12 dell’epatoma di topo vengono utilizzate per la costruzione di modelli in vitro e per studiare ulteriormente gli effetti farmacologici e i meccanismi sottostanti del PD in questo modello.

Il termine steatosi epatica non alcolica (NAFLD) si riferisce a un gruppo di malattie del fegato che include steatosi semplice, NASH, cirrosi e carcinoma epatocellulare¹¹. Sebbene la patogenesi della NAFLD non sia completamente compresa, dalla classica teoria “two-hit” all’attuale teoria “multiple-hit”, la resistenza all’insulina è considerata centrale nella patogenesi della NAFLD^12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che la resistenza all’insulina negli epatociti potrebbe portare ad un aumento degli acidi grassi liberi, che formano trigliceridi che si depositano nel fegato e causano il fegato a diventare grasso^15,16. L’accumulo di grasso può portare a lipotossicità, disfunzione mitocondriale indotta da stress ossidativo, stress del reticolo endoplasmatico e rilascio di citochine infiammatorie, con conseguente patogenesi e progressione della NAFLD^17,18. Inoltre, l’autofagia svolge anche un ruolo nella patogenesi della NAFLD, in quanto è coinvolta nella regolazione della sensibilità cellulare all’insulina, del metabolismo lipidico cellulare, del danno degli epatociti e dell’immunità innata 19,20,21.

Una varietà di modelli animali e modelli cellulari sono stati stabiliti per fornire una base per esplorare la patogenesi e potenziali bersagli terapeutici di NAFLD^22,23. Tuttavia, i singoli modelli animali non possono imitare completamente tutti i processi patologici della NAFLD²⁴. Le differenze individuali tra gli animali portano a diverse caratteristiche patologiche. L’utilizzo di linee cellulari epatiche o epatociti primari in studi in vitro di NAFLD garantisce la massima coerenza nelle condizioni sperimentali. La disregolazione del metabolismo lipidico epatico può portare a livelli più elevati di accumulo di goccioline lipidiche epatocitarie nella NAFLD²⁵. Gli acidi grassi liberi come l’acido oleico e l’olio di palma sono stati utilizzati nel modello in vitro per imitare la NAFLD causata da una dieta ricca di grassi^26,27. La linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 è spesso utilizzata nella costruzione di modelli NAFLD in vitro, ma, come linea cellulare tumorale, il metabolismo delle cellule HepG2 è significativamente diverso da quello delle cellule epatiche in normali condizioni fisiologiche²⁸. Pertanto, l’utilizzo di epatociti primari o epatociti primari di topo per costruire il modello NAFLD in vitro per lo screening farmacologico è più vantaggioso rispetto all’utilizzo di linee cellulari tumorali. Confrontando l’esame sinergico degli effetti dei farmaci e dei bersagli terapeutici sia in modelli animali che in modelli di epatociti in vitro, sembra che l’utilizzo di epatociti murini per costruire il modello NAFLD in vitro abbia un migliore potenziale applicativo.

Gli acidi grassi liberi che entrano nel fegato vengono ossidati per produrre energia o immagazzinati come trigliceridi. Significativamente, gli acidi grassi liberi hanno una certa lipotossicità e possono indurre disfunzione cellulare e apoptosi¹². L’acido palmitico (PA) è l’acido grasso saturo più abbondante nel plasma umano²⁹. Quando le cellule nel tessuto non adiposo sono esposte ad alte concentrazioni di PA per lungo tempo, questo stimola la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e provoca stress ossidativo, accumulo lipidico e persino apoptosi³⁰. Pertanto, molti ricercatori usano la PA come induttore per stimolare le cellule del fegato a produrre ROS e, quindi, costruire il modello di steatosi epatica in vitro e valutare gli effetti protettivi di alcuni principi attivi sulle cellule^31,32,33,34. Questo studio introduce un protocollo per studiare gli effetti protettivi del PD su un modello cellulare di NAFLD indotto da PA.

Protocol

Le cellule AML-12 (una normale linea cellulare di epatociti di topo) sono utilizzate per gli studi basati sulle cellule. Le celle sono ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). 1. Pretrattamento delle cellule AML-12 per modellare la NAFLD in vitro Mantenere le cellule in normali terreni di coltura cellulare (DMEM più F12 [1:1] di prosciutto contenente 0,005 mg/ml di insulina, 5 ng/mL di selenio, 0,005 mg/mL di transfe…

Representative Results

ROS intracellulari nelle celluleLe cellule AML-12 sono state indotte con 300 μM PA per 24 ore ed è stato stabilito un modello di cellule NAFLD. Successivamente, le cellule sono state trattate con PD per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con una sonda fluorescente DCFH-DA e la produzione di ROS è stata osservata al microscopio a fluorescenza. I risultati della colorazione DCFH-DA dei ROS intracellulari nelle cellule sono mostrati in Figura 1. I risultati hanno …

Discussion

Gli studi hanno evidenziato il fatto che la NAFLD è una sindrome clinicopatologica, che va dal fegato grasso alla NASH, che può progredire verso la cirrosi e il cancro al fegato⁵¹. Una dieta ricca di grassi e uno stile di vita inattivo sono fattori di rischio tipici per la NAFLD. Sono state studiate sia terapie non farmacologiche che terapie farmacologiche per il trattamento della NAFLD^51,52,53. Tuttavi…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004