Summary
Diyete bağlı alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) fare modeli kullanarak, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için non-invaziv bir yöntem olarak yeni in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi görüntüleme tekniklerinin kullanımını, ağırlıklı olarak hepatik vasküler ağa odaklanarak tanımladık.
Abstract
Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) büyüyen bir küresel sağlık sorunudur ve NAFLD'nin etkisi, mevcut etkili tedavilerin eksikliği ile birleşmektedir. NAFLD'nin zamanında ve doğru tanısını (derecelendirme dahil) ve izlenmesini ve potansiyel tedavilerin geliştirilmesini engelleyen önemli sınırlayıcı faktörler, hepatik mikroçevre yapısının karakterizasyonundaki mevcut yetersizlikler ve hastalık evresinin uzay-zamansal ve non-invaziv bir şekilde skorlanmasıdır. Diyete bağlı bir NAFLD fare modeli kullanarak, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yöntem olarak in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme tekniklerinin kullanımını araştırdık ve ağırlıklı olarak hepatik vasküler ağa odaklandık. Bu görüntüleme metodolojisi, karaciğer yağlanması ve fonksiyonel doku alımının uzunlamasına analizinin yanı sıra nispi kan hacminin, portal ven çapının ve vasküler ağın yoğunluğunun değerlendirilmesine izin verir. NAFLD progresyonu sırasında hepatik vasküler ağın adaptasyonlarını anlamak ve bunu, önerilen yöntemi kullanarak hastalığın ilerlemesini (steatoz, inflamasyon, fibrozis) karakterize etmenin diğer yollarıyla ilişkilendirmek, farelerde NAFLD araştırmaları için yeni, daha verimli ve tekrarlanabilir yaklaşımların oluşturulmasına giden yolu açabilir. Bu protokolün ayrıca, hastalığın ilerlemesine karşı yeni tedavilerin geliştirilmesini araştırmak için klinik öncesi hayvan modellerinin değerini yükseltmesi beklenmektedir.
Introduction
Alkole bağlı olmayan yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), toplumun yaklaşık %25'ini ve morbid obez kişilerin %>80'ini etkileyen metabolik bir hastalıktır1. Bu bireylerin yaklaşık üçte biri, hepatik steatoz, inflamasyon ve fibroz2 ile karakterize alkolsüz steatohepatit (NASH) hastalığına ilerler. NASH, siroz ve hepatosellüler karsinom (HCC) gelişimi için önemli ölçüde daha yüksek risk taşıyan bir hastalık evresidir3,4. Bu nedenle, NASH şu anda karaciğer transplantasyonunun en sık görülen ikinci nedenidir ve yakın zamanda karaciğer transplantasyonunun en önemli belirleyicisi haline gelmesi beklenmektedir 5,6,7. Prevalansına ve ciddiyetine rağmen, NAFLD için hastalığa özgü bir tedavi mevcut değildir ve mevcut tedaviler sadece insülin direnci ve hiperlipidemi gibi hastalıkla ilişkili patolojilerle mücadele etmeyi amaçlamaktadır 5,6.
Son yıllarda, endotelin ve genel olarak yağ dokusu ve karaciğer gibi metabolik dokuların vasküler ağının patofizyolojik rolü ve adaptasyonları, özellikle obezite ve metabolik düzensizlik sırasında araştırmalarda daha fazla önem kazanmaktadır 7,8. Endotel, vasküler ağı dahili olarak kaplayan, fonksiyonel ve yapısal bir bariyer görevi gören hücresel bir tek tabakadır. Ayrıca tromboz, metabolit taşınması, inflamasyon ve anjiyogenez gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlere de katkıda bulunur 9,10. Karaciğer durumunda, vasküler ağ, diğer özelliklerin yanı sıra, karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) olarak tanımlanan oldukça özelleşmiş hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. Bu hücreler bir bazal membrandan yoksundur ve kan ve karaciğer parankimi arasında substratların daha kolay transferine izin veren çoklu fenestralara sahiptir. Ayırt edici anatomik konumları ve özellikleri nedeniyle, LSEC'ler, NAFLD/NASH sırasında karaciğer iltihabı ve fibroz gelişimi de dahil olmak üzere karaciğerin patofizyolojik süreçlerinde muhtemelen çok önemli bir role sahiptir. Gerçekten de, LSEC'lerin NAFLD seyri sırasında maruz kaldığı patolojik, moleküler ve hücresel adaptasyonlar hastalığın ilerlemesine katkıda bulunur11. Spesifik olarak, NAFLD sırasında meydana gelen LSEC'ye bağlı hepatik anjiyogenez, inflamasyon gelişimi ve hastalığın NASH'e ve hatta HCC12'ye ilerlemesi ile önemli ölçüde ilişkilidir. Ayrıca, obezite ile ilişkili erken NAFLD, hepatik inflamasyon veya diğer ileri NAFLD belirtilerinin gelişmesinden önce gelen LSEC'lerde insülin direncinin gelişmesi ile karakterizedir13.
Ek olarak, LSEC'ler son zamanlarda çeşitli etiyolojilerin karaciğer hastalığı sırasında hepatik kan akışının ve vasküler ağ adaptasyonlarının merkezi düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır14,15. Gerçekten de, kronik karaciğer hastalığı, portal hipertansiyonun gelişimine katkıda bulunan belirgin intra-hepatik vazokonstriksiyon ve kan akışına karşı artan direnç ile karakterizedir16. NAFLD söz konusu olduğunda, LSEC ile ilgili birkaç mekanizma bu fenomene katkıda bulunur. Örneğin, yukarıda bahsedildiği gibi LSEC'ye özgü insülin direnci, hepatik vaskülatürün insüline bağlı vazodilatasyonunun azalmasıyla ilişkilidir13. Ayrıca, hastalığın seyri boyunca, karaciğer damar sistemi vazokonstriktörlere karşı daha duyarlı hale gelir, bu da hepatik kan akışının bozulmasına katkıda bulunur ve her ikisi de sinüzoidal mikrosirkülasyonun bozulmasına neden olan kayma stresinin ortaya çıkmasına neden olur17. Bu gerçekler, damar sisteminin karaciğer hastalığında önemli bir hedef olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, NAFLD/NASH'ın zamanında tanı ve izlenmesini ve potansiyel tedavilerin geliştirilmesini engelleyen sınırlayıcı faktörler, hepatik mikroçevrenin ve (mikro)vasküler yapının tutarlı karakterizasyonundaki yetersizliklerin yanı sıra hastalık evresinin uzay-zamansal ve non-invaziv bir şekilde skorlanmasıdır.
Mikro bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme, canlı bir organizmadaki anatomik bilgileri doğru bir şekilde tasvir etmek için şu anda altın standart non-invaziv görüntüleme yöntemidir. Mikro-BT ve MRG, çok çeşitli patolojileri kapsayabilen ve görüntülenen yapılarda ve dokularda olağanüstü çözünürlük ve ayrıntı sağlayabilen iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemini temsil eder. Özellikle mikro-BT, kemik hastalıkları ve ilişkili kemik yüzeyi değişiklikleri18 gibi patolojileri incelemek, pulmoner fibrozun zaman içindeki ilerlemesini değerlendirmek19, akciğer kanserini ve evrelemesiniteşhis etmek 20 ve hatta diş patolojileriniincelemek 21 için sıklıkla kullanılan çok hızlı ve doğru bir araçtır.
Mikro-BT'nin görüntüleme teknolojisi, X-ışınlarının madde ile etkileşimi açısından çeşitli organların farklı zayıflama özelliklerine dayanmaktadır. Yüksek X-ışını zayıflama farklılıkları gösteren organlar, BT görüntülerinde yüksek kontrastla gösterilir (yani, akciğerler karanlık ve kemikler açık görünür). Çok benzer zayıflama özellikleri gösteren organların (farklı yumuşak dokular) BT görüntülerinde ayırt edilmesi zordur22. Bu sınırlamayı ele almak için, iyot, altın ve bizmut bazlı özel kontrast maddeler, in vivo kullanım için kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Bu ajanlar, içinde biriktikleri dokuların zayıflama özelliklerini değiştirir, dolaşımdan yavaşça temizlenir ve tüm vasküler sistemin veya seçilen dokuların düzgün ve stabil opaklaşmasını sağlar23.
İnsan teşhisinde, BT görüntüleme ve MRI'dan türetilen proton yoğunluğu yağ fraksiyonu gibi karşılaştırılabilir teknikler, hepatik yağ içeriğinin belirlenmesi için halihazırda kullanılmaktadır24,25. NAFLD bağlamında, patolojik lezyonları veya küçük damarları doğru bir şekilde ayırt etmek için yüksek yumuşak doku kontrastı gereklidir. Bu amaçla karaciğer dokusu karakteristiklerinin arttırılmasını sağlayan kontrast maddeler kullanılır. Bu tür araçlar ve materyaller, vasküler ağın mimarisi ve yoğunluğu, lipid birikimi/steatozu ve karaciğerde fonksiyonel doku alımı/lipid (şilomikron) transferi gibi çoklu karaciğer özelliklerinin ve olası patoloji ifadelerinin incelenmesine izin verir. Ek olarak, hepatik bağıl kan hacmi ve portal ven çapı da değerlendirilebilir. Çok kısa bir tarama süresinde, tüm bu parametreler NAFLD'nin değerlendirilmesi ve ilerlemesi hakkında farklı ve tamamlayıcı bilgiler sağlar, bu da non-invaziv ve ayrıntılı bir tanı geliştirmek için kullanılabilir.
Bu makalede, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için non-invaziv bir yöntem olarak yeni in vivo mikro-BT görüntüleme tekniklerinin kullanımı için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak, karaciğer yağlanması ve fonksiyonel doku alımının uzunlamasına analizinin yanı sıra nispi kan hacminin, portal ven çapının ve vasküler ağın yoğunluğunun değerlendirilmesi, karaciğer hastalığının fare modellerinde gerçekleştirilebilir ve uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler BIOEMTECH personeli tarafından Avrupa ve ulusal refah yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve ulusal makamlar tarafından onaylanmıştır (lisans numarası EL 25 BIOexp 45 / PN 49553 21/01/20). Tüm deneyler ARRIVE yönergelerine26 bağlı kalınarak tasarlanmış ve raporlanmıştır. Fareler, Yunanistan'ın Atina kentindeki Hellenic Pasteur Enstitüsü'nden satın alındı.
NOT: Hayvanlar, 20-22 °C'de, %50-60 bağıl nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüne (ışık 07:00-19:00) sahip bir odada, raylar ve karton tüplerle zenginleştirilmiş, ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde grup halinde barındırılmıştır. Yüksek yağlı bir diyet (HFD) ve yüksek fruktozlu mısır şurubu (HFCS) kombinasyonu, modern yağla zenginleştirilmiş diyet türlerinde yaygın olarak kullanılan fruktoz ve glikoz içeren bir tatlandırıcı, NAFLD'yi tanınmış güvenilir bir model olarak indüklemek için kullanıldı27,28,29,30. 7-8 haftalıkken, erkek C57BL / 6 farelerine, kilokalorilerin% 10'unu yağdan içeren normal bir diyete (n = 2) veya 22 hafta boyunca% 5 HFCS ile takviye edilmiş yağdan kilokalorilerin% 60'ını içeren bir HFD'ye (n = 2) ad libitum erişimi verildi. Vücut ağırlığı, dijital bir terazi kullanılarak haftalık olarak elde edildi ve deney süresi boyunca, bir puan cetveli kullanılarak alternatif günlerde hayvan refahı izlendi. Görüntüleme protokolünün sonunda, farelere servikal çıkık yoluyla ötenazi yapıldı.
1. Hayvan hazırlama
NOT: Görüntüleme protokolü Şekil 1'de özetlenmiştir.
- Fareyi %3-4 izofluran (oda havasında) kullanarak uyuşturun ve özel bir ısıtma yastığı kullanarak vücut sıcaklığını koruyun.
NOT: Taramayı başlatmadan önce yeterli anestezi derinliğini doğrulamak için pedal çekme refleksinin olmaması kullanılmalıdır. - Deneyden önce hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün.
- Hayvanı CT tarayıcı yuvasına yerleştirin, burun konisini sabitleyin ve bakım için %1,5-%3 izoflurana (oda havasında) geçin.
NOT: Anestezinin sürdürülmesi için uygun izofluran yüzdesini doğrulamak için pedal çekme refleksinin olmaması kullanılmalıdır. - Fareyi sürekli izleyin.
2. Ön tarama hazırlığı
NOT: Görüntüleme, ilk kontrast maddesinin dolaşımdan ve dokulardan yeterince temizlenmesini sağlamak için iki deneysel aşamada gerçekleştirilir. Aşağıdaki "Görüntüleme iş akışı" bölümünde (bölüm 3) açıklandığı gibi, birinci aşamada eXIA (birinci kontrast madde) ve ikinci aşamada ExiTron (ikinci kontrast madde) uygulanır.
- Kontrast maddesinin (deney aşamasına bağlı olarak eXIA veya ExiTron) 3 saat boyunca oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
- CT tarayıcıda aşağıdaki tarama parametrelerini ayarlayın: 50 kVp tüp voltajı ve 460 μA akım altında yüksek çözünürlüklü protokol, spiral olmayan, 720 projeksiyon/rotasyon, dört dönüş ve 4 dakikalık çekim süresi.
3. Görüntüleme iş akışı
- Deneysel aşama 1
- Maksimum kontrast için seyreltilmemiş 6 μL/g vücut ağırlığı dozunda uygulanacak ilk kontrast maddesinin hacmini hesaplayın ve hazırlayın.
- Kuyruk ven kateterini salinle doldurarak ve kontrast madde ile dolu şırıngaya bağlayarak hazırlayın.
- Kontrast öncesi tüm vücut (WB) ve karaciğer taban çizgisi taraması elde edin.
- Şırınga veya kateterde kabarcık veya tıkanıklık olmadığından emin olun.
- Önceden doldurulmuş kateteri kuyruk damarına yerleştirin ve kontrast maddeyi 1-3 dakikalık bir süre ile (bolus enjeksiyonu olarak değil) yavaş ve manuel olarak gerçekleştirilen bir enjeksiyonla uygulayın. Uygun infüzyon hızına ayarlandığında bir şırınga pompası kullanılabilir.
NOT: Hayvanın kuyruğu, vazodilatasyonu indüklemek ve kateter yerleştirilmesine yardımcı olmak için ılık suya yerleştirilebilir - Tablo 1'de gösterildiği gibi WB ve karaciğer taramalarını farklı zaman noktalarında alın.
NOT: Tüm noktaların elde edilmesi mümkün değilse, maksimum karaciğer alım noktası olan enjeksiyondan 45 dakika sonra (PI) ve klerensin sağlandığı 48 saat PI'ye odaklanılmalıdır.
- Deneysel aşama 2
- İlk kontrast madde (48 saat PI) ile son okumadan 10 gün sonra ikinci kontrast maddenin uygulanması için fareyi bölüm 1'de açıklandığı gibi tekrar hazırlayın.
- 2.1-2.2 adımlarını gerçekleştirin.
- Maksimum kontrast için vücut ağırlığının 8 μL/g'lik seyreltilmemiş bir dozunda uygulanacak ikinci kontrast maddesinin hacmini hesaplayın ve hazırlayın.
- Kuyruk ven kateterini salinle doldurarak ve kontrast madde ile dolu şırıngaya bağlayarak hazırlayın.
- Göreceli kan hacmini ve karaciğer yağlanmasını değerlendirmek için kontrast öncesi WB ve karaciğer başlangıç taraması edinin.
- İlk kontrast maddesinin tamamen temizlendiğinin bir göstergesi olarak taramada hiçbir kontrastın algılanmadığından emin olun.
- Önceden doldurulmuş kateteri kuyruk damarına yerleştirin ve kontrast maddeyi 1-3 dakikalık bir süre ile (bolus enjeksiyonu olarak değil) yavaş ve manuel olarak gerçekleştirilen intravenöz enjeksiyon yoluyla uygulayın. Uygun infüzyon hızına ayarlandığında bir şırınga pompası kullanılabilir.
- Tablo 1'de gösterildiği gibi WB ve karaciğer taramalarını farklı zaman noktalarında alın.
NOT: WB taramaları 10 dakika ve 4 saat PI'de alınır. Aralarındaki önemli zaman atlaması, vücuttaki izleyici biyodağılımının yanı sıra nispi açıklığının değerlendirilmesine izin verir.
4. Veri çıkarma ve analiz
NOT: Bu protokolde, belirli bir görüntüleme işleme yazılımına (bkz. Malzeme Tablosu) dayalı veri çıkarma ve analiz adımları sağlanır. Farklı yazılımlar kullanılırken açıklanan adımların uyarlanması gerekebilir.
- Hepatik lipid birikimi / steatozunun değerlendirilmesi.
NOT: Hepatik steatozun değerlendirilmesi için kontrast madde kullanılmaz ve kontrol ile patoloji arasında bir karşılaştırma yapılır. Farklı fareler arasındaki doku zayıflama özelliklerindeki nispeten yüksek sapmalar nedeniyle, yoğunluk değerleri, dalağa (yağsız doku) ve yağa (mutlak yağ dokuları) karşı karaciğer için aşağıdaki denkleme göre ve daha önce açıklandığı gibinormalleştirilir 25:
- Analizi gerçekleştirmek için kontrast öncesi taramanın DICOM dosyasını yükleyin ve karaciğer, dalak ve beyaz yağ dokusunu (WAT) net bir şekilde görmek için çubuğu/kontrastı ayarlayın.
- Ön paneldeki araç açılır menüsünden Modelleme Operatörü aracına erişin ve 3D ROI Aracı'nı seçin.
- 3D ROI Operatörü altında, karaciğerin (tercihen sol medial lob, sağ medial lob ve sol lateral lob bölgelerinde) ve dalağın görünür kan damarları ve yağ olmadan berrak göründüğü alanlarda örnekleme yapmak üzere birden fazla ROI (her doku için sekize kadar) oluşturmak için ROI Ekle'yi seçin.
NOT: WAT için ROI'ler, viseral yağ dokusu deposunun ortasında seçilir. Önerilen alanlar Şekil 2'de gösterilmiştir. Karaciğer/dalak oranını kullanan ve WAT dahil edilmeden normalizasyon yöntemleri de daha önce belirlendiği gibi uygulanabilir31. - 3D Boyama Modu ve Aşındırma/Dilate özelliği altında, 2D'yi seçin ve her ROI için bir ad ve renk belirtmek üzere görüntülenen arabirimi kullanın.
- 2B ROI'leri manuel olarak çizmek için 8 piksel çapındaki Sphere boyama ROI aracını kullanın.
- Şekil 3A'da gösterildiği gibi, enine düzlemde Artı İmleci aracını kullanarak 2B ROI'leri ilgilenilen alanlara bölerek örnekleme gerçekleştirin.
- Şekil 3B'de gösterildiği gibi 2D ROI'nin segmentasyonunu tamamlamak için sagital ve koronal düzlemde seçilen noktaya tıklayın.
- ROI'lerin geri kalanını tanımlamak için işlemi tekrarlayın.
NOT: Örnekleme yaparken, organ sınır bölgelerinden kaçının, çünkü bu gürültüye neden olabilir ve her bir ROI'nin hesaplanan Hounsfield birimi (HU) değerinin güvenilirliğini etkileyebilir. - Segmentlere ayrılmış YG'lerden memnun kaldığınızda, Gezinti'ye gidin ve her bir YG için hesaplanan HU değerlerini içeren niceleme tablosunu görüntülemek için Tabloyu Göster'i seçin.
NOT: İlgilenilen değerler, ilgilenilen organlar için ROI'lerde bulunan voksellerin (HU) sayısal ortalama değerlerini içeren "Ortalama" sütununda listelenmiştir. İlgilendiğiniz değerleri not edin veya Tabloyu Dışa Aktar'ı seçerek tablonun tamamını kaydedin. - Karaciğer, dalak ve WAT için ortalama HU'yu hesaplayın ve karaciğer yağ yüzdesini hesaplamak için değerleri yukarıdaki denkleme ekleyin.
- Karaciğerde fonksiyonel doku tutulumu/lipid (şilomikron) transferi
NOT: Fonksiyonel doku alımı/lipid (şilomikron) transferi, daha önce yayınlanmış bir yönteme32 dayalı olarak, ilk kontrast madde infüzyonunu takiben 45 dakika ve 48 saat sonra elde edilen taramalardan analiz edilir. Kontrast, aşağıdaki denklem kullanılarak farklı dokular ve zaman noktaları için hesaplanır:
PV organı ti, t i zamanında (0 saat ile 48 saat arasında değişen) organdaki ortalama piksel değeridir ve PV organı t0, görüntüdeki organdaki kontrastsız ortalama piksel değeridir.- Bu analizi gerçekleştirmek için eXIA tarama DICOM dosyasını yükleyin ve karaciğeri, dalağı ve sol ventrikülü net bir şekilde görmek için çubuğu/kontrastı ayarlayın.
- Ön paneldeki araç açılır menüsünden Modelleme İşleci'ne erişin ve 3D ROI Aracı'nı seçin.
- 3D ROI Operatörü altında, karaciğer için birden fazla ROI'yi segmentlere ayırmak için ROI Ekle'yi seçin.
- 3B Boyama Modu ve Aşındırma/Genişletme özelliği altında, 8 piksel çapında ve −1 aşındırma özelliğine sahip Küre boyama ROI aracını kullanın.
NOT: Her organın net bir şekilde göründüğü dilimlerde birden fazla ROI seçin. Sınır bölgelerinden kaçının, çünkü bu gürültüye neden olabilir ve her bir ROI'nin hesaplanan HU değerinin güvenilirliğini etkileyebilir. Bu, küçük organ hacimlerine karşılık gelen birden fazla 3D ROI'nin örneklenmesiyle sonuçlanacaktır. - Her ROI için bir ad ve renk belirtmek için görünen arayüzü kullanın.
- Tasarlanan ROI'lerden memnun kaldığınızda, Gezinti'ye gidin ve her ROI için hesaplanan HU değerlerini içeren niceleme tablosunu görüntülemek için Tabloyu Göster'i seçin.
NOT: İlgilenilen değerler, ROI'ye dahil edilen voksellerin (HU) sayısal ortalama değerlerini gösteren "Ortalama" sütununun altında listelenmiştir. Her organın ROI'lerinin ortalama HU değeri, PV organı ti'ye karşılık gelir. İlgilendiğiniz değerleri not edin veya Tabloyu Dışa Aktar'ı seçerek tablonun tamamını kaydedin. - PV organ t0'ı elde etmek için, kontrast madde enjeksiyonundan önce karaciğer, dalak ve sol ventrikülün ortalama parlaklığını hesaplamak için kontrast öncesi DICOM dosyasını kullanarak yukarıdaki adımların tümünü tekrarlayın.
- Fonksiyonel doku alımı/lipid (şilomikron) transferine karşılık gelen kontrast yüzdesini çıkarmak için değerleri yukarıdaki denkleme ekleyin.
- Hepatik vasküler ağın mimarisi ve yoğunluğu
NOT: Hepatik vasküler ağın mimarisinin ve yoğunluğunun analizi, daha önce yayınlanmış bir metodolojiye dayanmaktadır.33 ve ikinci kontrast maddenin 10 dakikalık PI'si elde edilen karaciğer taramaları üzerinde gerçekleştirilir.- Bu analizi gerçekleştirmek için ExiTron tarama DICOM dosyasını yükleyin ve karaciğer vasküler ağını net bir şekilde görmek için çubuğu/kontrastı ayarlayın.
- Ön paneldeki araç açılır menüsünden Modelleme İşleci'ne erişin ve 3D ROI Aracı'nı seçin.
- 3D ROI Operatörü altında, karaciğer için bir 3D ROI oluşturmak için ROI Ekle'yi seçin.
- 3B Boyama Modu ve Aşındırma/Genişletme özelliğinin altında 3B'yi seçin.
NOT: Koronal düzlem boyunca segmentasyon katmanlarını tanımlamak için −1 aşındırma ile Küre boyama ROI aracını kullanın. ROI boyama aracının çapı her katmana göre ayarlanmalıdır (istenen/istenmeyen voksel seçimlerini eklemek/silmek için). Karaciğer hacminin başlangıçta koronal düzlem boyunca tanımlanması önerilir ve daha sonra ROI'yi düzeltmek için enine ve sagital düzlemler kullanılabilir. Bu işlem hassasiyet gerektirir. Kullanıcı, karaciğerin tüm alanlarının tanımlanan ROI'ye dahil edilmesini sağlarken, her bir ROI katmanını bölümlere ayırırken diğer dokuları, damarları ve kemikleri dahil etmemeye çok dikkat etmelidir. Bu nedenle karaciğerin anatomik sınırlarına aşina olmak çok önemlidir. - Elde edilen karaciğer ROI'sinden memnun kaldıktan sonra, başlangıçta segmentlere ayrılmış karaciğer ROI'sine ait olmayan tüm vokselleri görüntü verilerinden çıkarmak için bir kesim yapın. Bunun için ROI Seçiciden karaciğer ROI'sini seçin ve Kesim Gerçekleştir simgesine tıklayın. Bu işlem arka planı kaldırır ve karaciğer ROI'sini değiştirmeden bırakır.
NOT: Geri alma/yineleme işlevleri 3D ROI Aracı altında gerçekleştirilen tüm işlemler için geçerli olsa da, ROI'yi kesme eylemi geri alınamaz. Bu nedenle, bu eylemden önce, kullanıcı ilk karaciğer ROI'sini DICOM biçiminde kaydetmeyi düşünebilir. - Ortaya çıkan karaciğer ROI'si, çıkarılması gereken vasküler ağı ve çevresindeki dokuyu içerir. Bunun için ROI'yi sıfırla süpürge düğmesine tıklayarak karaciğer ROI'sini sıfırlayın.
- Karaciğer ROI'sinin tüm piksellerini arka plana aktarmak için görünen arayüzü kullanın.
NOT: Karaciğer ROI'si bu işlemden sonra da var olmaya devam edecek, ancak artık herhangi bir voksel içermeyecektir. - Karaciğer ROI'sini yalnızca vasküler ilişkili pikselleri içerecek şekilde yeniden segmentlere ayırmak için, sihirli değnek simgesiyle gösterilen Segmentasyon Algoritmaları'na gidin ve Bağlı Eşikleme'yi seçin.
- Eşik uygulamadan önce giriş açılır menüsünden ROI'yi Çıktı ve arka planı Giriş olarak tanımlayın.
- Maksimum ve minimum değerleri doldurmak ve vasküler ağı elde etmek için her eşik alanının solundaki Min ve Max simgelerine tıklayarak Eşikleri ayarlayın.
NOT: Elde edilen ROI'ye yalnızca seçilen aralıktaki pikseller dahil edilecektir. Farklı hayvanlar arasındaki eşik değerlerin ayarlanması, her bir hayvana enjekte edilen kontrast madde miktarına göre aynı anatomik bölgelerin dikkate alınmasını sağlar. Bu, sayısal değerler aynı olmasa bile seçilen dokular arasında sabittir. - Vasküler ağın net göründüğü bir noktaya tıklamak için Artı İşareti aracını kullanın ve segmentasyonu gerçekleştirmek için Uygula'ya tıklayın.
- Maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) görüntüleyiciyi etkinleştirin.
- Ortaya çıkan karaciğer ROI'sini, vasküler ağın MIP görünümünde ne kadar net göründüğü açısından değerlendirin.
- Doku, karaciğer ROI'sinin bazı kısımlarında kalırsa, segmentli karaciğer ROI'si vasküler ağı açıkça temsil edene kadar Min eşik değerini ayarlayarak 4.3.5-4.3.11 adımlarını tekrarlayın.
- Elde edilen karaciğer ROI'sinden memnun kaldıktan sonra, milimetre küp cinsinden hesaplanan karaciğer ROI hacmini içeren niceleme tablosunu oluşturun.
NOT: İlgilenilen değerler, karaciğer ROI'sinde bulunan voksellerin (HU) sayısal hacim değerini içeren "mm3" sütununda listelenmiştir. İlgilendiğiniz değerleri not edin veya Tabloyu Dışa Aktar'ı seçerek tablonun tamamını kaydedin.
- Hepatik bağıl kan hacmi
NOT: Fibroz ilerlemesi sırasında yeni oluşan kan damarlarının miktarı ile önemli ölçüde ilişkili olan hepatik bağıl kan hacminin (rBV) ölçümü için, ikinci kontrast madde enjeksiyonundan 4 saat sonra kontrast öncesi taramalar ve taramalar kullanılır. Analiz, daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirilir34.- Bu analizi gerçekleştirmek için ExiTron tarama DICOM dosyasını yükleyin ve çubuğu/kontrastı ayarlayın.
NOT: MIP görüntüleyiciyi devre dışı bırakın: Tercihler altında, yükleme sırasında MIP görüntüleyiciyi devre dışı bırakmak için kutuyu işaretleyin. Büyük veri kümeleri için bu, yükleme hızını artırabilir. - Ön paneldeki araç açılır menüsünden Modelleme İşleci'ne erişin ve 3D ROI Aracı'nı seçin. Bu araç, hem 2B hem de 3B bölgeleri çizmek, görselleştirmek, kaydetmek ve ölçmek için gelişmiş seçenekler sunar.
- 3D ROI Operatörü altında, ROI Ekle'yi seçin ve iki ROI'yi segmentlere ayırın: biri karaciğer ve diğeri büyük bir kan damarı için.
- 3D Boyama Modu ve Aşındırma/Genişletme özelliğinin altında 2D'yi seçin.
NOT: Karaciğer için 8-10 piksel, kan damarı için 4-6 piksel çapında Sphere boya ROI aracının kullanılması tavsiye edilir. Ancak seçilecek alanın ne kadar küçük olduğuna bağlı olarak boya aleti çapı ayarlanabilir. - Her ROI için bir ad ve renk belirtmek için görünen arayüzü kullanın.
NOT: İlgilenilen dokuların merkezi kısımlarından iki ila beş dilim seçin ve her doku için 2D ROI'ler oluşturmak için segmentasyon katmanlarını tanımlayın. Her dilimdeki alanları seçerken, Şekil 4'te gösterildiği gibi organ sınır bölgelerinden kaçının, çünkü bu gürültüye neden olabilir ve her bir ROI'nin hesaplanan HU değerinin güvenilirliğini etkileyebilir. - Tasarlanan ROI'lerden memnun kaldığınızda, Gezinti'ye gidin ve her ROI için hesaplanan HU değerlerini içeren niceleme tablosunu görüntülemek için Tabloyu Göster'i seçin.
NOT: İlgilenilen değerler, ROI'ye dahil edilen voksellerin (HU) sayısal ortalama değerlerini gösteren "Ortalama" sütununun altında listelenmiştir. İlgilendiğiniz değerleri not edin veya Tabloyu Dışa Aktar'ı seçerek tablonun tamamını kaydedin. - Kontrast madde enjeksiyonundan önce karaciğerin ortalama parlaklığını elde etmek için kontrast öncesi DICOM dosyası için tüm adımları tekrarlayın. Bunun için sadece karaciğer için 4.4.2-4.4.5 adımlarını uygulayın.
- Eşdeğer zaman noktalarında her doku için ortalama HU değerlerini hesaplayın ve elde edilen değerleri aşağıdaki denkleme ekleyin:
NOT: Kontrast madde enjeksiyonundan sonra büyük bir kan damarı %100 rBV olarak kabul edilir ve kontrast madde uygulamasından önce karaciğer %0 rBV olarak kabul edilir.
- Bu analizi gerçekleştirmek için ExiTron tarama DICOM dosyasını yükleyin ve çubuğu/kontrastı ayarlayın.
- Portal ven çapı
NOT: Portal ven çapı ölçümleri için, hepatik rBV ölçümleri için kullanılan aynı taramalar daha önce tarif edildiği gibianaliz edilir 35.- ExiTron tarama DICOM dosyasını yükleyin ve çubuğu/kontrastı ayarlayın.
- Superior mezenterik ve splenik venlerin birleştiği yerin üzerinde üç ila dört dilimin enine düzlemlerini bulun (Şekil 5).
- İki nokta arasındaki tam mesafeyi (yani dairesel damar bölgesinin çapını) ölçmek için Cetvel aracını kullanın.
NOT: Mesafe görüntüden çıkarılır, ancak hesaplanan mesafeyi içeren niceleme tablosunu görüntülemek için Navigasyon'a gidip Tabloyu Göster'i seçebilir veya sonucu kaydetmek için Tabloyu Dışa Aktar'ı seçebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu temsili çalışmada, herhangi bir kontrast madde içermeyen mikro-BT görüntüleme, NAFLD'li farelerde kontrollere kıyasla daha yüksek bir karaciğer yağı yüzdesi gösterdi (Tablo 2), bu da patolojiyi doğruladı. ExiTron kontrast maddesi ve yukarıda açıklanan hepatik vasküler ağ mimarisi ve yoğunluk analizi kullanılarak, hepatik vasküler ağın toplam hacim yoğunluğunun NAFLD'li farelerde sağlıklı kontrollere kıyasla daha yüksek olduğu bulunmuştur (Şekil 6, Tablo 2). NAFLD'li fareler ayrıca kontrol farelerine kıyasla daha büyük bir portal ven çapına sahipti (Tablo 2), karaciğer hastalığı sırasında portal hipertansiyon ile ilişkili yapısal bir değişiklik34,36,37. Benzer şekilde, NAFLD'li hayvanların hepatik rBV'sinin sağlıklı kontrollere göre daha yüksek olduğu hesaplanmıştır (Tablo 2).
Ayrıca, fonksiyonel doku alım testinin analizi, sağlıklı kontrollere kıyasla NAFLD'li farelerde eXIA kontrast maddesinin daha yüksek bir birikimini ve daha yavaş klerensini göstermiştir (Şekil 7). Bu sonuçlar, steatotik hepatositlerin, azalmış metabolik katabolizma veya klerens / sekresyon ile birlikte olmasına rağmen, muhtemelen yüksek düzeyde hücresel endositoz ve dağılıma maruz kaldığını göstermektedir. Genel olarak, bu bulgu, yağ infiltrasyonu / NAFLD38,39 durumunda beklendiği gibi, azalmış hepatik metabolik aktivite fenotipi ile uyumludur.
Şekil 1: Deneysel protokole genel bakışı gösteren şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karaciğer (kırmızı), dalak (yeşil) ve WAT (mavi) için 2D ROI'yi bölümlere ayırmak üzere örnekleme yapmak için kullanılan önerilen alanları vurgulayan temsili görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Steatozun hesaplanması için 2D ROI'nin bölümlere ayrılmasının temsili örneği . (A) Artı İşareti aracı, enine düzlemde karaciğerin istenen bir bölgesinde 2D ROI seçmek için kullanılır. (B) İşlem, 2D ROI'nin segmentasyonunu tamamlamak için sagital ve koronal düzlemlerde tekrarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 2D karaciğer yatırım getirisi oluşturmak için bir segmentasyon katmanının temsili örneği. Organın orta kısımları, gürültüyü ortadan kaldırmak için sınır bölgelerinden kaçınarak manuel olarak seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 2B eksenel alan. NAFLD ve sağlıklı kontrollere sahip farelerde portal ven çapını ölçmek için seçilen farklı dilimlerin 2D eksenel alanının temsili örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hepatik vasküler ağ mimarisi. Bir kontrol faresinden (176.9 mm 3) ve NAFLD'li bir fareden (390.3 mm3) elde edilen BT segmentasyonu ile gösterildiği gibi hepatik vasküler ağ mimarisinin temsili çıkarılmış görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Ortalama kontrast değerleri. NAFLD'li farelerde (n = 2) ve sağlıklı kontrollerde (n = 2) eXIA enjeksiyonundan 48 saat sonra hepatik doku alımını temsil eden ortalama kontrast değerlerini gösteren gruplandırılmış veriler. Gruplandırılan tüm veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| ExiA (Sergi) | ExiTron (İngilizce) | |||
| Zaman Noktası | Tüm Vücut Taraması | Karaciğer Taraması | Tüm Vücut Taraması | Karaciğer Taraması |
| Ön kontrast | X | X | X | X |
| 10 dk PI | - | - | - | X |
| 15 dk PI | O | O | - | - |
| 45 dk PI | X | X | - | - |
| 2 saat PI | O | O | - | - |
| 4 saat PI | - | - | X | X |
| 24 saat PI | O | O | - | - |
| 48 saat PI | X | X | - | - |
Tablo 1: BT taramalarının zaman noktaları. Tüm vücut ve karaciğerin uygun zaman noktaları, kontrast maddelerin enjeksiyon öncesi ve sonrası (PI) taramalarını yapar. X zorunlu taramaları, - tarama yapılmadığını ve O isteğe bağlı (önerilen ancak zorunlu olmayan) taramaları gösterir.
| Kontrol (n = 1–2) | NAFLD (n = 1-2) | |
| % Karaciğer yağı | %2,4 ± %1,5 | %18,4 ± %3,1 |
| Hepatik vasküler ağ hacmi | 176,9 mm3 | 390,3 mm3 |
| Portal ven çapı | 1,1 Milimetre | 1,4 Milimetre |
| Hepatik bağıl kan hacmi | ~%54 | ~%79 |
Tablo 2: NAFLD'li fareler ile sağlıklı kontroller arasında karaciğer yağı, hepatik vasküler ağ hacmi, portal ven çapı ve hepatik bağıl kan hacmi yüzdesindeki farklılıkları gösteren temsili sonuçlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsanlarda NAFLD tanısı ve evrelemesi için önerilen güncel yöntem, örnekleme yanlışlıklarının yanı sıra kanama karmaşıklığı riskini de barındıran karaciğer biyopsisidir40. Aksine, hayvan modellerinde, bu tür bir tanı ölüm sonrası histoloji ile gerçekleştirilir, ancak hayatta kalabilir karaciğer biyopsisi için protokoller artık mevcuttur ve çalışma tasarımı izin verdiğinde önerilir41. Ölüm sonrası histolojinin kullanılması, bu hastalığın ilerlemesini araştırmak için çok sayıda hayvanın gerekli olduğu anlamına gelir. Hal böyle olunca hastalık ilerlerken aynı hayvanda çalışma yapılamaz; Farklı hayvanlardan farklı zaman noktalarında elde edilen numuneler karşılaştırıldığında değişkenliğin de daha yüksek olması beklenmektedir. Bu makalede, NAFLD'nin yerleşik bir deneysel hayvan modelinde uygulanan, karaciğer steatozu ve fonksiyonel doku tutulumu, bağıl kan hacmi, portal ven çapı ve vasküler ağın yoğunluğu gibi fonksiyonel parametrelerin ölçülmesi yoluyla hastalık ilerlemesinin uzunlamasına değerlendirilmesini sağlayan yenilikçi, invaziv olmayan bir in vivo mikro-BT yaklaşımı sunuyoruz. aynı hayvanda.
Mikro-BT görüntüleme, canlı bir organizmadaki anatomik bilgiyi doğru bir şekilde tasvir etmek için şu anda altın standart non-invaziv görüntüleme yöntemidir. Mikro-BT, yüksek bir uzamsal çözünürlüğe ulaşma yeteneğine sahiptir, bu nedenle çok çeşitli patolojilerde çok ince ayrıntıları incelemek için değerli bir araçtır. Ayrıca, görüntülenen numunenin bütünlüğüne müdahale etmeden X-ışınlarının içsel özelliklerinden yararlanarak hastalığın zaman içindeki ilerlemesini incelemek için hızlı ve güvenilir bir araçtır21,22,23,24. Hayvan araştırmalarında bu tekniğin en büyük avantajlarından biri, herhangi bir karmaşık preparat (non-invaziv) olmadan uygulanan seçilmiş kontrast ajanların bir kombinasyonunu kullanma yeteneğidir. Bu, hastalığın ilerlemesi sırasında uzunlamasına taranan aynı hayvandan birkaç parametrenin çıkarılmasına izin vererek, maksimum çıktı ve ARRIVE yönergelerine ve 3Rs26'ya uyumu sağlar. Ayrıca, mikro-CT tarayıcıları, sonuçların 2D ve 3D formatlarında yorumlanması nispeten kolay (özellikle kullanıcı dostu yazılım kullanıldığında) çok kısa çekim sürelerinde (sadece birkaç dakika veya daha kısa tarama süreleriyle) yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
Bu protokolde tarif edilen tüm taramalar küçük bir kemirgen BT tarayıcısında gerçekleştirildi (bkz. BT sistemi spiral tarama yapar ve 100 μm çözünürlükte görüntü sağlayabilir. 35-80 kVp ve 10-500 μA tüp akımı arasında çalışır. CT veri alımları tarama başına 7-10 dakika sürer ve 100 μm uzamsal çözünürlükte bir görüntü alanı yeniden yapılandırma algoritması (ISRA) aracılığıyla yeniden oluşturulur. BT görüntüleme aşağıdaki parametreler kullanılarak gerçekleştirilir: i) WB taramaları için 50 kVp'de yüksek çözünürlüklü protokol ve ii) lokal karaciğer taramaları için 50 kVp'de yüksek çözünürlüklü çok rotasyonlu yerel tarama. Tüm parametreler, kullanıcı arayüzündeki talimatlar izlenerek sistemle birlikte verilen tarama cihazı yazılımında (bkz. Malzeme Tablosu) ayarlanır. Yeniden yapılandırma, voksel boyutu 0,1 mm olan bir Feldkamp, Davis ve Kress (FDK) algoritması aracılığıyla gerçekleştirilir. Artefaktlar meydana gelirse, halka artefaktına neden olan sorunlu dedektör uzaktan iptal edilebilir ve görüntü düzeltilebilir.
Tarif edilen teknik protokol, özel formülasyonları ve çeşitli dokulardaki zamansal biyokinetikleri nedeniyle seçilen eXIA ve ExiTron kontrast maddeleri kullanılarak optimize edildi. eXIA, X-ışını zayıflatıcı ajan olarak 160 mg/mL iyot içeren, tamamen biyolojik olarak parçalanabilen bir kontrast maddedir. İntravenöz olarak enjekte edildikten sonra, bu kontrast madde kanın kalma süresini gösterir (>30 dakikalık bir boşluk süresi ile) ve daha sonra karaciğer, dalak, miyokard ve kahverengi yağ dokusu gibi metabolik olarak aktif organlar tarafından alınır. Bu nedenle ilk kontrast madde, karaciğer ve dalak anormalliklerinin, miyokard enfarktüsünün ve kardiyomiyopatinin non-invaziv in vivo tespiti ve ayrıca aktif kahverengi yağ dokusunun tanımlanması ve ölçülmesi için uygundur. ExiTron, klinik öncesi BT görüntüleme için özel olarak formüle edilmiş, ~12.000 HU seyreltilmemiş yoğunluk42'ye sahip alkali toprak metal bazlı bir nanopartikül kontrast maddesidir. İntravenöz enjeksiyonda, ikinci kontrast madde kan dolaşımında dolaşır ve karaciğer içindeki makrofajlar da dahil olmak üzere retiküloendotelyal sistemin43 hücreleri tarafından alınır.
Önerilen metodoloji ile ilgili belirli sınırlamalar vardır. Bu protokolün başarılı olması için, ikinci kontrast madde uygulanmadan önce birinci kontrast maddeden BT sinyali tespit edilmemelidir. Bu protokolde önerilen zaman çerçevesi, optimizasyon deneyleri (ve diğer çalışmalara dayanarak) (ve diğer çalışmalara dayanarak) 44 seçilmiştir, bu da ilk kontrast maddesinin yavaş klirense sahip olduğunu göstermiştir. İkinci kontrast madde daha da yavaş bir klirens oranına sahip olduğundan45,46, birinci kontrast maddenin tamamen temizlenmesini takiben ikinci olarak uygulanmalıdır. Gerçekten de, enjeksiyondan 12 gün sonra ilk kontrast maddenin klirensinin tatmin edici olduğunu belirledik. Kullanılan hayvan modelinin süresine bağlı olarak, bu zaman ölçeği karaciğer hastalığının ilerlemiş olabileceği iki zaman noktasının karşılaştırılmasına izin verebilir. Burada kullanılan beslenme protokolünün 22 hafta sürdüğü göz önüne alındığında 12 günlük bir zaman atlamasının hastalığın ilerlemesinde önemli değişikliklere neden olması beklenmemektedir. Deneycinin, önerilen görüntüleme protokolünü ayarlamadan önce uygun doğrulama ve optimizasyonu gerçekleştirmesi gerekir. Kullanılan kontrast maddelerin türünü ve konsantrasyonunu ve ayrıca uygulama zaman çerçevesini değiştirmeden önce ilerlemenin ve görüntü sinyalinin maliyet-fayda analizi de değerlendirilmelidir.
Ek olarak, her iki kontrast madde de hayvan için toksik seviyelere ulaşmadan önce yalnızca belirli bir toplam uygulama hacmine kadar tolere edilebilir43. Optimal kontrastı sağlamak için maksimum kontrast madde hacminin gerekli olması nedeniyle, ajanların yavaş temizleme oranı ile birlikte, bu analiz için tek seferlik bir enjeksiyon önerilmektedir. Kontrast maddenin toplam hacmi herhangi bir zaman noktasında önerilen sınırın altında kaldığı sürece, bu veya diğer uygun alternatif kontrast maddelerinin tekrarlanan uygulamaları da farklı deneyler için kullanılabilir. Bu mikro-BT protokolünü kullanarak başarılı görüntüleme için bir diğer gereklilik de kontrast maddelerin doğru uygulanmasıdır. Protokolde belirtildiği gibi, deneyci, herhangi bir kabarcık olmadan, ajanın uygun dozajda doğrudan damar yoluyla kan dolaşımına yavaş bir şekilde infüzyonunu sağlamalıdır. Bunun yapılmaması, görüntüleme çözünürlüğünü ve çıktılarını tehlikeye atacaktır. Bu nedenle, optimal bir dozajın ve uygun uygulama yöntemlerinin (farklı ajanlar arasında infüzyon ve süre) seçilmesi, BT görüntülemede toksisite riskini ve ilişkili sınırlamaları azaltır.
Birden fazla zaman noktasında tarama için, anestezi süresinin mümkün olduğunca kısa tutulmasına dikkat edilmelidir. BT taramasının tamamlanması yalnızca birkaç dakika sürdüğünden, uzun süreli anestezi süreleriyle ilişkili riski en aza indirmek için anestezi bazı taramalar arasında tersine çevrilebilir. Tekrarlanan anestezi indüksiyonlarının da riskleri vardır. Bununla birlikte, hayvanları taramalar arasında ısıtılmış bir ped üzerine yerleştirmek ve yeterli hidrasyonun sağlanması, iyileşmeye ve fizyolojinin korunmasına yardımcı olur. Ayrıca, X-ışınları tarafından yayılan iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma, organ ve hücre biyolojisini etkilemek için yeterlidir, bu da bunu hayvanlar için potansiyel olarak zararlı hale getirir ve sonuç olarak önyargılı ve yanıltıcı deneysel verilere neden olur22. Tarama başına verilmesi beklenen doz yaklaşık 385 mGy olduğundan, çalışma sırasında birden fazla tarama alan fareler 1.8 Gy veya daha fazlasını alabilir. Bu, doku biyolojileri üzerinde potansiyel olarak zararlı etkileri olabilecek fareler için önemli bir radyasyon dozudur. Bu özellikle endişe vericidir, çünkü aynı görüntü kalitesini korurken izotropik voksel aralığını azaltırken dozda bir artış gerekir22.
Önerilen yazılım kullanılarak görüntü işleme sonrası açısından (bkz. Malzeme Tablosu), segmentasyon maskeleri, bölge büyütme ve eşikleme araçlarının bir karışımı kullanılarak oluşturulur ve bu, analizin en çok zaman alan adımıdır. Bazı durumlarda, elde edilen segmentasyonların manuel modifikasyonları bir yumuşatma yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmelidir. İstenen ağın kenar koruma ve gürültü azaltma özelliklerini optimize etmek için, 0,3 değerine sahip bir Gauss filtresi öneririz. Böyle bir vasküler ağın temsili görüntüleri Şekil 6'da gösterilmektedir (açık erişimli bir DICOM tıbbi görüntü görüntüleyici kullanılarak sonradan işlenmiştir). Vasküler ağın ölçülmesi açısından temel sınırlama, yazılımın seçilen tanımlanmış ROI'yi (karaciğerin vasküler ağını temsil eder) arka plandan (çevreleyen karaciğer dokusunu temsil eder) doğru bir şekilde ayırma yeteneğine sahip olmamasıdır; Bu nedenle, uygun eşik deneme yanılma yoluyla seçilmelidir. Başlangıçta, kullanıcı 600 HU'luk daha düşük bir eşik değeri ve maksimum 10.000 HU tanımlar. Çıkarılan damar ağı ve çevre dokudan ayrılması kabul edilemezse, 50-100 HU'luk kademeli değişiklikleri takiben deneme yanılma yoluyla düşük değer ayarlanır. Damar ağı dokudan yeterince ayrılana kadar işlem kullanıcı tarafından tekrarlanır.
Sonuç olarak, NAFLD progresyonu sırasında hepatik vasküler ağın adaptasyonlarını anlamak ve önerilen yöntemi kullanarak bunları diğer hastalık karakterizasyon yöntemleriyle ilişkilendirmek, farelerde NAFLD araştırmaları için yeni, daha verimli ve tekrarlanabilir yaklaşımların oluşturulmasına giden yolu açabilir. Bu protokolün ayrıca, hastalığın ilerlemesine karşı yeni tedavilerin geliştirilmesini araştırmak için klinik öncesi hayvan modellerinin değerini yükseltmesi beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 - A.C.) tarafından desteklenmiştir. Anna Hadjihambi, Roger Williams Hepatoloji Enstitüsü, Karaciğer Araştırmaları Vakfı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
