Summary
Med hjälp av en dietinducerad icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) musmodell beskriver vi användningen av nya in vivo mikrodatortomografiavbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD, med övervägande fokus på det hepatiska vaskulära nätverket på grund av dess betydande engagemang i NAFLD-relaterad leverdysreglering.
Abstract
Icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) är ett växande globalt hälsoproblem, och effekterna av NAFLD förvärras av den nuvarande bristen på effektiva behandlingar. Avsevärda begränsande faktorer som hindrar snabb och korrekt diagnos (inklusive gradering) och övervakning av NAFLD, liksom utvecklingen av potentiella terapier, är de nuvarande bristerna i karakteriseringen av leverns mikromiljöstruktur och poängsättningen av sjukdomsstadiet på ett spatiotemporalt och icke-invasivt sätt. Med hjälp av en dietinducerad NAFLD-musmodell undersökte vi användningen av in vivo mikrodatortomografi (CT) avbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD, med övervägande fokus på det hepatiska vaskulära nätverket på grund av dess betydande involvering i NAFLD-relaterad leverdysreglering. Denna avbildningsmetodik möjliggör longitudinell analys av leversteatos och funktionellt vävnadsupptag, samt utvärdering av den relativa blodvolymen, portvendiametern och densiteten i det vaskulära nätverket. Att förstå anpassningarna av det hepatiska vaskulära nätverket under NAFLD-progression och korrelera detta med andra sätt att karakterisera sjukdomsprogressionen (steatos, inflammation, fibros) med hjälp av den föreslagna metoden kan bana väg för etableringen av nya, mer effektiva och reproducerbara metoder för NAFLD-forskning på möss. Detta protokoll förväntas också uppgradera värdet av prekliniska djurmodeller för att undersöka utvecklingen av nya terapier mot sjukdomsprogression.
Introduction
Icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) är en metabol sjukdom som drabbar cirka 25 % av befolkningen och >80 % av sjukligt överviktiga personer1. Uppskattningsvis en tredjedel av dessa individer utvecklar till icke-alkoholisk steatohepatit (NASH), som kännetecknas av leversteatos, inflammation och fibros2. NASH är ett sjukdomsstadium med en signifikant högre risk för utveckling av cirros och hepatocellulärt karcinom (HCC)3,4. Av denna anledning är NASH för närvarande den näst vanligaste orsaken till levertransplantation, och den förväntas också snart bli den viktigaste prediktorn för levertransplantation 5,6,7. Trots dess förekomst och svårighetsgrad finns ingen sjukdomsspecifik behandling tillgänglig för NAFLD, och de befintliga behandlingarna syftar endast till att ta itu med sjukdomsassocierade patologier som insulinresistens och hyperlipidemi 5,6.
Under de senaste åren har endotelets patofysiologiska roll och anpassningar och i allmänhet det vaskulära nätverket av metaboliska vävnader, såsom fettvävnaden och levern, fått allt större betydelse i forskningen, särskilt vid fetma och metabol dysreglering 7,8. Endotelet är ett cellulärt monolager som fodrar det vaskulära nätverket internt och fungerar som en funktionell och strukturell barriär. Det bidrar också till olika fysiologiska och patologiska processer, såsom trombos, metabolittransport, inflammation och angiogenes 9,10. När det gäller levern kännetecknas det vaskulära nätverket bland annat av närvaron av högspecialiserade celler, definierade som leverns sinusformade endotelceller (LSEC). Dessa celler saknar ett basalmembran och har flera fenestrae, vilket möjliggör en enklare överföring av substrat mellan blodet och leverparenkymet. På grund av deras distinkta anatomiska läge och egenskaper har LSEC sannolikt en avgörande roll i leverns patofysiologiska processer, inklusive utvecklingen av leverinflammation och fibros under NAFLD/NASH. Faktum är att de patologiska, molekylära och cellulära anpassningar som LSEC genomgår under NAFLD bidrar till sjukdomsprogressionen11. Specifikt är den LSEC-beroende leverangiogenesen som äger rum under NAFLD signifikant associerad med utvecklingen av inflammation och progressionen av sjukdomen till NASH eller till och med HCC12. Dessutom kännetecknas fetmarelaterad tidig NAFLD av utvecklingen av insulinresistens i LSEC, som föregår utvecklingen av leverinflammation eller andra avancerade NAFLD-tecken13.
Dessutom har LSEC nyligen dykt upp som centrala regulatorer för leverns blodflöde och vaskulära nätverksanpassningar under leversjukdom av flera etiologier14,15. Faktum är att kronisk leversjukdom kännetecknas av framträdande intrahepatisk vasokonstriktion och ökad motståndskraft mot blodflödet, vilket bidrar till utvecklingen av portal hypertension16. När det gäller NAFLD bidrar flera LSEC-relaterade mekanismer till detta fenomen. Till exempel är LSEC-specifik insulinresistens, som nämnts ovan, förknippad med minskad insulinberoende vasodilatation av leverns kärl13. Dessutom blir leverns kärl under sjukdomsförloppet känsligare för vasokonstriktorer, vilket ytterligare bidrar till försämring av blodflödet i levern och leder till uppkomsten av skjuvspänning, vilket båda resulterar i en störning av den sinusformade mikrocirkulationen17. Dessa fakta tyder på att kärlen är ett viktigt mål vid leversjukdom. Begränsande faktorer som hindrar snabb diagnos och övervakning av NAFLD/NASH, liksom utvecklingen av potentiella terapier, är dock bristerna i den konsekventa karakteriseringen av leverns mikromiljö och (mikro)vaskulära struktur, samt poängsättningen av sjukdomsstadiet på ett spatiotemporalt och icke-invasivt sätt.
Mikrodatortomografi (CT) är för närvarande den gyllene standarden för icke-invasiv avbildningsmetod för att exakt avbilda anatomisk information i en levande organism. Mikro-CT och MRT representerar två kompletterande avbildningsmetoder som kan täcka ett brett spektrum av patologier och ge exceptionell upplösning och detaljrikedom i de avbildade strukturerna och vävnaderna. Micro-CT, i synnerhet, är ett mycket snabbt och exakt verktyg som ofta används för att studera patologier som bensjukdomar och tillhörande förändringar på benytan18, bedöma utvecklingen av lungfibros över tid19, diagnostisera lungcancer och dess stadieindelning20, eller till och med undersöka tandpatologier21, utan någon speciell förberedelse (eller förstörelse) av proverna som avbildas.
Avbildningstekniken för mikro-CT är baserad på de olika dämpningsegenskaperna hos olika organ när det gäller röntgenstrålars interaktion med materia. Organ som uppvisar stora skillnader i röntgendämpning avbildas med hög kontrast i CT-bilder (dvs. lungorna ser mörka ut och benen ljusa). Organ som uppvisar mycket likartade dämpningsegenskaper (olika mjukvävnader) är svåra att urskilja på CT-bilder22. För att ta itu med denna begränsning har specialiserade kontrastmedel baserade på jod, guld och vismut undersökts i stor utsträckning för in vivo-användning . Dessa medel förändrar dämpningsegenskaperna hos de vävnader i vilka de ackumuleras, rensas långsamt från cirkulationen och möjliggör en enhetlig och stabil opacifiering av hela kärlsystemet eller utvalda vävnader23.
Inom humandiagnostik används redan datortomografi och jämförbara tekniker, t.ex. MRT-härledd fettfraktion med protondensitet, för bestämning av leverfetthalt24,25. I samband med NAFLD är hög mjukvävnadskontrast avgörande för att korrekt särskilja patologiska lesioner eller små kärl. För detta ändamål används kontrastmedel som ger ökad kontrast av levervävnadens egenskaper. Sådana verktyg och material gör det möjligt att studera flera leveregenskaper och möjliga patologiska uttryck, såsom kärlnätverkets arkitektur och densitet, lipidavsättning/steatos och funktionellt vävnadsupptag/lipidöverföring (kylomikron) i levern. Dessutom kan leverns relativa blodvolym och portvendiameter också utvärderas. På mycket kort skanningstid ger alla dessa parametrar olika och kompletterande information om utvärdering och progression av NAFLD, som kan användas för att utveckla en icke-invasiv och detaljerad diagnos.
I den här artikeln tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för användning av nya in vivo mikro-CT-avbildningstekniker som en icke-invasiv metod för att bedöma progressionsstadierna av NAFLD. Med hjälp av detta protokoll kan den longitudinella analysen av leversteatos och funktionellt vävnadsupptag, samt utvärderingen av den relativa blodvolymen, portvendiametern och densiteten i det vaskulära nätverket, utföras och tillämpas i musmodeller av leversjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes av BIOEMTECHs personal i enlighet med europeiska och nationella djurskyddsbestämmelser och godkändes av nationella myndigheter (licensnummer EL 25, BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alla experiment utformades och rapporterades i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna26. Mössen köptes från Hellenic Pasteur Institute i Aten, Grekland.
OBS: Djuren inhystes i individuellt ventilerade burar berikade med skenor och papprör i ett rum vid 20-22 °C, med en relativ luftfuktighet på 50%-60% och en 12 timmars ljus/mörker-cykel (ljus 07:00-19:00). En kombination av en fettrik kost (HFD) och majssirap med hög fruktoshalt (HFCS), ett fruktos- och glukoshaltigt sötningsmedel som ofta används i moderna typer av fettberikade dieter, användes för att inducera NAFLD som en erkänd pålitlig modell27,28,29,30. Vid 7-8 veckors ålder fick C57BL/6-möss ad libitum tillgång till antingen en normal diet (n = 2) med 10 % av kilokalorierna från fett eller en HFD (n = 2) innehållande 60 % av kilokalorierna från fett kompletterat med 5 % HFCS i vatten under 22 veckor. Kroppsvikten erhölls veckovis med hjälp av en digital våg, och under försöksperioden övervakades djurens välbefinnande varannan dag med hjälp av ett poängblad. I slutet av avbildningsprotokollet avlivades mössen via cervikal luxation.
1. Beredning av djur
OBS: Bildprotokollet sammanfattas i figur 1.
- Bedöva musen med 3%-4% isofluran (i rumsluft) och behåll kroppstemperaturen med hjälp av en särskild värmedyna.
OBS: Frånvaron av en pedalutdragningsreflex måste användas för att bekräfta tillräckligt anestesidjup innan skanningen påbörjas. - Applicera ögonsalva på djurets ögon före experimentet.
- Placera djuret i datortomografens vagga, fäst noskonen och byt till 1,5-3 % isofluran (i rumsluften) för underhåll.
OBS: Frånvaron av en pedalutdragningsreflex måste användas för att bekräfta lämplig procenttage av isofluran för upprätthållande av anestesi. - Övervaka musen kontinuerligt.
2. Förberedelse före skanning
OBS: Avbildning utförs i två experimentella faser för att möjliggöra att det första kontrastmedlet avlägsnas tillräckligt från cirkulationen och vävnaderna. eXIA (första kontrastmedel) administreras i den första fasen och ExiTron (andra kontrastmedel) i den andra fasen, enligt beskrivningen i avsnittet "Arbetsflöde för bildbehandling" (avsnitt 3) nedan.
- Låt kontrastmedlet (antingen eXIA eller ExiTron, beroende på experimentfasen) uppnå rumstemperatur i 3 timmar.
- Ställ in följande skanningsparametrar på CT-skannern: högupplöst protokoll under 50 kVp rörspänning och en ström på 460 μA, icke-spiral, 720 projektioner/rotation, fyra varv och 4 minuters insamlingstid.
3. Arbetsflöde för bildbehandling
- Experimentell fas 1
- Beräkna och bered volymen av det första kontrastmedlet som ska administreras i en outspädd dos på 6 μL/g kroppsvikt för maximal kontrast.
- Bered svansvenskatetern genom att fylla den med koksaltlösning och ansluta den till sprutan fylld med kontrastmedel.
- Skaffa en pre-contrast helkropps- (WB) och leverbaslinjeskanning.
- Se till att det inte finns några bubblor eller blockeringar i sprutan eller katetern.
- För in den förfyllda katetern i svansvenen och administrera kontrastmedlet via en injektion som utförs långsamt och manuellt, med en varaktighet på 1-3 minuter (inte som en bolusinjektion). En sprutpump kan användas när den är inställd på lämplig infusionshastighet.
OBS: Djurets svans kan placeras i ljummet vatten för att inducera vasodilatation och hjälpa till med kateterinförandet - Ta WB- och leverskanningar vid olika tidpunkter, som anges i tabell 1.
OBS: Om det inte är möjligt att samla in alla punkter, bör fokus läggas på 45 minuter efter injektion (PI), vilket är punkten för maximalt leverupptag, och 48 timmar PI, vilket är när clearance uppnås.
- Experimentell fas 2
- Förbered musen igen enligt beskrivningen i avsnitt 1 för administrering av det andra kontrastmedlet 10 dagar efter den sista avläsningen med det första kontrastmedlet (48 timmar per tablett).
- Utför steg 2.1-2.2.
- Beräkna och bered volymen av det andra kontrastmedlet som ska administreras i en outspädd dos på 8 μL/g kroppsvikt för maximal kontrast.
- Bered svansvenskatetern genom att fylla den med koksaltlösning och ansluta den till sprutan fylld med kontrastmedel.
- Skaffa en pre-kontrast WB och leverbaslinjeskanning för att utvärdera den relativa blodvolymen och leversteatosen.
- Se till att ingen kontrast kan detekteras i skanningen som en indikation på fullständig frigång av det första kontrastmedlet.
- För in den förfyllda katetern i svansvenen och administrera kontrastmedlet via en intravenös injektion som utförs långsamt och manuellt, med en varaktighet på 1-3 minuter (inte som en bolusinjektion). En sprutpump kan användas när den är inställd på lämplig infusionshastighet.
- Ta WB- och leverskanningar vid olika tidpunkter, som anges i tabell 1.
OBS: WB-skanningar tas vid 10 min och 4 h PI. Den betydande tidsfördröjningen mellan dem gör det möjligt att utvärdera spårämnets biodistribution i kroppen samt dess relativa clearance.
4. Extrahering och analys av data
OBS: I detta protokoll tillhandahålls dataextraktions- och analysstegen baserade på en specifik programvara för bildbehandling (se Materialförteckning). De beskrivna stegen kan behöva anpassas när du använder olika programvaror.
- Utvärdering av leverlipiddeposition/steatos.
OBS: För utvärdering av leversteatos används inget kontrastmedel och en jämförelse mellan kontroll och patologi utförs. På grund av relativt höga avvikelser i vävnadsdämpningsegenskaper mellan olika möss normaliseras densitetsvärdena för levern mot mjälten (fettfri vävnad) och fettet (absolut fettvävnad) enligt följande ekvation och som tidigare beskrivits25:
- För att utföra analysen, ladda DICOM-filen för förkontrastskanningen och justera stapeln/kontrasten för att se levern, mjälten och vit fettvävnad (WAT) tydligt.
- Gå till verktyget Modelling Operator via verktygets rullgardinsmeny på frontpanelen och välj 3D ROI Tool.
- Under 3D ROI-operatorn väljer du Lägg till ROI för att generera flera ROI (upp till åtta för varje vävnad) för att utföra provtagning i de områden där levern (helst i områdena för den vänstra mediala loben, den högra mediala loben och den vänstra laterala loben) och mjälten verkar tydliga, utan synliga blodkärl och fett.
OBS: För WAT väljs ROI i mitten av den viscerala fettvävnadsdepån. Rekommenderade områden visas i figur 2. Normaliseringsmetoder som använder lever/mjälte-kvoten och utan att inkludera WAT kan också tillämpas som tidigare fastställts31. - Under funktionen 3D-målningsläge och erodera/vidga väljer du 2D och använder gränssnittet som visas för att ange ett namn och en färg för varje ROI.
- Använd ROI-verktyget för sfärmålning med en diameter på 8 pixlar för att manuellt rita 2D-ROI:erna.
- Utför sampling genom att segmentera 2D-ROI på de intressanta områdena med hjälp av hårkorsverktyget på tvärplanet, som visas i figur 3A.
- Klicka på den valda punkten i sagittal- och koronaplanet för att slutföra segmenteringen av 2D ROI, som visas i figur 3B.
- Upprepa processen för att definiera resten av ROI:erna.
OBS: Vid sampling, undvik organgränsområdena, eftersom detta kan introducera brus och påverka tillförlitligheten för det beräknade Hounsfield-enhetsvärdet (HU) för varje ROI. - När du är nöjd med de segmenterade ROI:erna går du till Navigering och väljer Visa tabell för att visa kvantifieringstabellen som innehåller de beräknade HU-värdena för varje ROI.
OBS: Värdena av intresse listas i kolumnen "Medelvärde", som innehåller de numeriska medelvärdena för voxlarna (HU) som finns i ROI för de berörda organen. Anteckna de värden som är av intresse eller spara hela tabellen genom att välja Exportera tabell. - Beräkna den genomsnittliga HU för lever, mjälte och WAT och koppla in värdena i ekvationen ovan för att beräkna procentandelen leverfett.
- Funktionellt vävnadsupptag/lipidöverföring (kylomikron) i levern
OBS: Funktionellt vävnadsupptag/lipidöverföring (chylomikron) analyseras från de erhållna skanningarna 45 minuter och 48 timmar efter den första infusionen av kontrastmedel, baserat på en tidigare publicerad metod32. Kontrasten beräknas för de olika vävnaderna och tidpunkterna med hjälp av ekvationen nedan:
PV-orgel t i är det genomsnittliga pixelvärdet i orgeln vid tiden t i (från 0 h till 48 h), och PV-orgel t0 är det genomsnittliga pixelvärdet i orgeln i bilden utan kontrast.- För att utföra denna analys, ladda eXIA-skanningen DICOM-filen och justera stapeln/kontrasten för att se levern, mjälten och vänster kammare tydligt.
- Gå till modelleringsoperatören via verktygets rullgardinsmeny på frontpanelen och välj 3D ROI-verktyg.
- Under 3D ROI-operatorn väljer du Lägg till ROI för att segmentera flera ROI för levern.
- Under funktionerna 3D-målningsläge och erodera/vidga använder du ROI-verktyget för sfärmålning med en diameter på 8 pixlar och −1 eroderar.
OBS: Välj flera ROI:er på skivor där varje organ visas tydligt. Undvik gränsregioner, eftersom detta kan leda till brus och påverka tillförlitligheten för det beräknade HU-värdet för varje ROI. Detta kommer att resultera i provtagning av flera 3D ROIs, som motsvarar små organvolymer. - Använd gränssnittet som visas för att ange ett namn och en färg för varje ROI.
- När du är nöjd med de utformade ROI:erna går du till Navigering och väljer Visa tabell för att visa kvantifieringstabellen som innehåller de beräknade HU-värdena för varje ROI.
OBS: Värdena av intresse listas under kolumnen "Medelvärde", som visar de numeriska medelvärdena för voxlarna (HU) som ingår i ROI. Det genomsnittliga HU-värdet för varje organs ROI motsvarar PV-organet ti. Anteckna de värden som är av intresse eller spara hela tabellen genom att välja Exportera tabell. - För att erhålla PV-organ t0, upprepa alla ovanstående steg med hjälp av DICOM-filen före kontrasten för att beräkna den genomsnittliga ljusstyrkan för levern, mjälten och vänster kammare före kontrastmedelsinjektionen.
- Sätt in värdena i ekvationen ovan för att extrahera den procentuella kontrast som motsvarar det funktionella vävnadsupptaget/lipidöverföringen (kylomikron).
- Arkitektur och densitet i det hepatiska vaskulära nätverket
OBS: Analysen av arkitekturen och densiteten i det hepatiska vaskulära nätverket är baserad på en tidigare publicerad metodik33 och utförs på leverskanningar erhållna 10 min PI av det andra kontrastmedlet.- För att utföra denna analys, ladda ExiTron skanna DICOM-filen och justera stapeln/kontrasten för att se leverns vaskulära nätverk tydligt.
- Gå till modelleringsoperatören via verktygets rullgardinsmeny på frontpanelen och välj 3D ROI-verktyg.
- Under 3D ROI-operatorn väljer du Lägg till ROI för att generera en 3D-ROI för levern.
- Under 3D-målningsläge och erodera/dilatera funktion väljer du 3D.
OBS: Använd ROI-verktyget för sfärfärg med −1 erod för att definiera segmenteringsskikten över koronaplanet. Diametern på ROI-målningsverktyget måste justeras för varje lager (för att lägga till/ta bort önskade/oönskade voxelval). Det rekommenderas att levervolymen initialt definieras över koronaplanet, och sedan kan de tvärgående och sagittala planen användas för att korrigera ROI. Denna process kräver precision. Användaren måste vara mycket noga med att inte inkludera andra vävnader, kärl och ben när man segmenterar varje ROI-skikt samtidigt som man säkerställer att alla delar av levern ingår i den definierade ROI. Av denna anledning är det viktigt att bekanta sig med leverns anatomiska gränser. - När du är nöjd med den resulterande lever-ROI, utför ett snitt för att ta bort alla voxlar från bilddata som inte hör hemma i den initialt segmenterade lever-ROI. För detta, välj leverns ROI från ROI-väljaren och klicka på ikonen Utför skärning . Denna operation tar bort bakgrunden och lämnar leverns ROI oförändrad.
OBS: Även om funktionerna för att ångra/göra om är tillämpliga på alla operationer som utförs under 3D ROI-verktyget, kan åtgärden att klippa en ROI inte ångras. Innan den här åtgärden vidtas kan användaren därför överväga att spara den första lever-ROI i DICOM-format. - Den resulterande leverns ROI inkluderar det vaskulära nätverket och den omgivande vävnaden, som måste avlägsnas. För detta, återställ leverns ROI genom att klicka på knappen Återställ ROI-kvast .
- Använd gränssnittet som visas för att överföra alla pixlar i leverns ROI till bakgrunden.
OBS: Leverns ROI kommer fortfarande att finnas efter denna operation, men den kommer inte längre att innehålla några voxlar. - Om du vill segmentera om leverns ROI så att den bara innehåller vaskulära associerade pixlar går du till Segmenteringsalgoritmer som betecknas med trollstavsikonen och väljer Ansluten tröskel.
- Definiera ROI som Utdata och bakgrunden som Indata från rullgardinsmenyn för indata innan du tillämpar tröskelvärde.
- Ställ in trösklarna genom att klicka på Min - och Max-ikonerna till vänster om varje tröskelfält för att fylla i max- och minimivärden och få det vaskulära nätverket.
OBS: Endast pixlar inom det valda intervallet kommer att inkluderas i den resulterande ROI. Genom att justera tröskelvärdena mellan olika djur säkerställs att samma anatomiska regioner beaktas med avseende på den exakta mängden kontrastmedel som injiceras i varje djur. Detta är konstant bland de valda vävnaderna även om de numeriska värdena inte är identiska. - Använd hårkorsverktyget för att klicka på en punkt där det vaskulära nätverket verkar tydligt och klicka på Verkställ för att utföra segmenteringen.
- Aktivera MIP-visningen (maximal intensitetsprojektion).
- Utvärdera den resulterande lever-ROI i termer av hur tydligt det vaskulära nätverket ser ut i MIP-vyn.
- Om vävnaden finns kvar i delar av leverns ROI, upprepa steg 4.3.5-4.3.11 genom att justera Min-tröskelvärdet tills den segmenterade leverns ROI tydligt representerar det vaskulära nätverket.
- När du är nöjd med den resulterande lever-ROI, generera kvantifieringstabellen som innehåller den beräknade lever-ROI-volymen i kubikmillimeter.
OBS: Värdena av intresse listas i kolumnen "mm3", som innehåller det numeriska volymvärdet för voxlarna (HU) som finns i leverns ROI. Anteckna de värden som är av intresse eller spara hela tabellen genom att välja Exportera tabell.
- Leverns relativa blodvolym
OBS: För mätning av den relativa levervolymen (rBV), som korrelerar signifikant med mängden nybildade blodkärl under fibrosprogression, används förkontrastskanningar och skanningar 4 timmar efter den andra kontrastmedelsinjektionen. Analysen utförs som tidigare beskrivits34.- För att utföra den här analysen, ladda ExiTron Scan DICOM-filen och justera stapeln/kontrasten.
OBS: Inaktivera MIP-visningsprogrammet: under Inställningar markerar du rutan för att inaktivera MIP-visningsprogrammet vid inläsning. För stora datamängder kan detta förbättra inläsningshastigheten. - Gå till modelleringsoperatören via verktygets rullgardinsmeny på frontpanelen och välj 3D ROI-verktyg. Det här verktyget ger avancerade alternativ för att rita, visualisera, spara och kvantifiera både 2D- och 3D-regioner.
- Under 3D ROI-operatorn väljer du Lägg till ROI och segmenterar två ROI: en för levern och en för ett stort blodkärl.
- Under 3D-målningsläge och erodera/dilatera funktion väljer du 2D.
OBS: Vi rekommenderar att du använder ROI-verktyget för sfärfärg med en diameter på 8-10 pixlar för levern och 4-6 pixlar för blodkärlet. Färgverktygets diameter kan dock justeras beroende på hur litet område som ska väljas är. - Använd gränssnittet som visas för att ange ett namn och en färg för varje ROI.
Välj två till fem skivor av centrala delar av vävnaderna av intresse och definiera segmenteringsskikten för att generera 2D-ROI för varje vävnad. När du väljer områden på varje skiva ska du undvika organgränsområdena, som visas i figur 4, eftersom detta kan introducera brus och påverka tillförlitligheten för det beräknade HU-värdet för varje ROI. - När du är nöjd med de utformade ROI:erna går du till Navigering och väljer Visa tabell för att visa kvantifieringstabellen som innehåller de beräknade HU-värdena för varje ROI.
OBS: Värdena av intresse listas under kolumnen "Medelvärde", som visar de numeriska medelvärdena för voxlarna (HU) som ingår i ROI. Anteckna de värden som är av intresse eller spara hela tabellen genom att välja Exportera tabell. - Upprepa alla steg för DICOM-filen före kontrasten för att få leverns genomsnittliga ljusstyrka före kontrastmedelsinjektionen. För detta, utför steg 4.4.2-4.4.5 endast för levern.
- Beräkna de genomsnittliga HU-värdena för varje vävnad vid motsvarande tidpunkter och sätt in de erhållna värdena i ekvationen nedan:
OBS: Ett stort blodkärl efter injektion av kontrastmedel anses vara 100 % rBV, och levern, före administrering av kontrastmedel, anses vara 0 % rBV.
- För att utföra den här analysen, ladda ExiTron Scan DICOM-filen och justera stapeln/kontrasten.
- Portal vendiameter
OBS: För mätningarna av portvendiametern analyseras samma skanningar som används för leverns rBV-mätningar som tidigare beskrivits35.- Ladda ExiTron-skannings-DICOM-filen och justera stapeln/kontrasten.
- Lokalisera de tvärgående planen med tre till fyra skivor ovanför korsningen mellan de övre tarmkäx- och mjältvenerna (figur 5).
- Använd linjalverktyget för att mäta det exakta avståndet mellan två punkter (dvs. diametern på det cirkulära venområdet).
OBS: Avståndet extraheras på bilden, men man kan också gå till Navigation och välja Visa tabell för att visa kvantifieringstabellen som innehåller det beräknade avståndet eller välja Exportera tabell för att spara resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna representativa studie indikerade mikro-CT-avbildning utan kontrastmedel en högre andel leverfett hos möss med NAFLD jämfört med kontroller (tabell 2), vilket bekräftar patologin. Med hjälp av kontrastmedlet ExiTron och den vaskulära nätverksarkitekturen och densitetsanalysen i levern som beskrivs ovan, visade sig den totala volymtätheten i det hepatiska vaskulära nätverket vara högre hos möss med NAFLD jämfört med friska kontroller (Figur 6, tabell 2). Möss med NAFLD hade också en större portvendiameter jämfört med kontrollmöss (tabell 2), en strukturell förändring associerad med portal hypertension under leversjukdom34,36,37. På liknande sätt beräknades lever-rBV hos djur med NAFLD vara högre jämfört med friska kontroller (tabell 2).
Dessutom indikerade analysen av det funktionella vävnadsupptagstestet en högre ackumulering och långsammare clearance av eXIA-kontrastmedlet hos möss med NAFLD jämfört med friska kontroller (Figur 7). Dessa resultat tyder på att steatotiska hepatocyter sannolikt genomgår höga nivåer av cellulär endocytos och distribution, men åtföljs av minskad metabolisk katabolism eller clearance/sekretion. Sammantaget överensstämmer detta fynd med fenotypen för minskad metabolisk aktivitet i levern, vilket förväntas i fallet med fettinfiltration/NAFLD38,39.
Figur 1: Schematisk översikt över det experimentella protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder som belyser de föreslagna områdena som används för att utföra provtagning för segmentering av 2D ROI för levern (röd), mjälten (grön) och WAT (blå). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativt exempel på segmentering av en 2D ROI för beräkning av steatos. (A) Hårkorset används för att välja en 2D ROI på ett önskat område av levern på tvärplanet. (B) Processen upprepas på sagittal- och koronaplanen för att slutföra segmenteringen av 2D ROI. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativt exempel på ett segmenteringsskikt för att generera en 2D-avkastning på levern. Centrala delar av orgeln väljs manuellt, vilket undviker gränsområdena för att eliminera brus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: 2D axiell area. Representativa exempel på den axiella 2D-arean av de olika skivorna som valts ut för att mäta portvendiametern hos möss med NAFLD och friska kontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Vaskulär nätverksarkitektur i levern. Representativa extraherade bilder av leverns vaskulära nätverksarkitektur, som visas genom CT-segmentering, erhållna från en kontrollmus (176,9 mm 3) och en mus med NAFLD (390,3 mm3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Genomsnittliga kontrastvärden. Grupperade data som visar de genomsnittliga kontrastvärdena, som representerar levervävnadsptaget under 48 timmar efter injektion av eXIA hos möss med NAFLD (n = 2) och friska kontroller (n = 2). Alla grupperade data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| ExiA | ExiTron | |||
| Tidpunkt | Helkroppsskanning | Leverskanning | Helkroppsskanning | Leverskanning |
| Före kontrast | X | X | X | X |
| 10 min PI | - | - | - | X |
| 15 min PI | O | O | - | - |
| 45 min PI | X | X | - | - |
| 2 h PI | O | O | - | - |
| 4 h PI | - | - | X | X |
| 24 h PI | O | O | - | - |
| 48 h PI | X | X | - | - |
Tabell 1: Tidpunkter för datortomografin. Lämpliga tidpunkter för helkropps- och leverskanningar förvärvade före och efter injektion (PI) av kontrastmedlen. X indikerar obligatoriska genomsökningar, - indikerar inga genomsökningar och O anger valfria (rekommenderas men inte obligatoriska) genomsökningar.
| Styrning (n = 1–2) | NAFLD (n = 1–2) | |
| % Leverfett | 2,4 ± 1,5 % | 18,4 ± 3,1 % |
| Leverns vaskulära nätverksvolym | 176,9 mm3 | 390,3 mm3 |
| Portal vendiameter | En mm 1.1 | En mm storlek 1,4 |
| Leverns relativa blodvolym | ~54 % | ~79 % |
Tabell 2: Representativa resultat som indikerar skillnader i procentuell andel leverfett, vaskulär nätverksvolym i levern, portvensdiameter och relativ levervolym mellan möss med NAFLD och friska kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den för närvarande rekommenderade metoden för NAFLD-diagnos och stadieindelning på människor är leverbiopsi, som medför risk för blödningskomplexitet, samt provtagningsfelaktigheter40. Tvärtom, i djurmodeller utförs sådan diagnos genom histologi post-mortem, även om protokoll för överlevnadsbar leverbiopsi nu finns tillgängliga och rekommenderas när studiedesignen tillåter41. Användningen av histologi efter döden innebär att ett stort antal djur krävs för att undersöka sjukdomsförloppet. En studie kan därför inte utföras på samma djur medan sjukdomen fortskrider. Variabiliteten förväntas också vara högre när man jämför prover som erhållits vid olika tidpunkter från olika djur. I den här artikeln tillhandahåller vi en innovativ, icke-invasiv in vivo mikro-CT-metod, tillämpad i en etablerad experimentell djurmodell av NAFLD, som möjliggör longitudinell utvärdering av sjukdomsprogression genom kvantifiering av funktionella parametrar, nämligen leversteatos och funktionellt vävnadsupptag, den relativa blodvolymen, portvendiametern och det vaskulära nätverkets densitet, hos samma djur.
Mikro-CT-avbildning är för närvarande den gyllene standarden för icke-invasiv avbildningsmetod för att exakt avbilda anatomisk information i en levande organism. Micro-CT har förmågan att nå en hög rumslig upplösning, vilket är ett värdefullt verktyg för att studera mycket fina detaljer i ett stort antal patologier. Dessutom är det ett snabbt och tillförlitligt verktyg för att studera sjukdomsprogression över tid21,22,23,24 genom att utnyttja röntgenstrålarnas inneboende egenskaper utan att störa integriteten hos det avbildade provet. En stor fördel med denna teknik i djurförsök är möjligheten att använda en kombination av utvalda kontrastmedel som administreras utan några komplicerade preparat (icke-invasiva). Detta gör det möjligt att extrahera flera parametrar från samma djur som skannas longitudinellt under sjukdomsförloppet, vilket säkerställer maximal effekt och överensstämmelse med ARRIVE-riktlinjerna och 3Rs26. Dessutom ger mikro-CT-skannrar högupplösta bilder på mycket korta insamlingstider (med skanningstider på bara några minuter eller mindre), och tolkningen av resultaten i 2D- och 3D-format är relativt enkel (särskilt när man använder användarvänlig programvara, som föreslås här).
Alla skanningar som beskrivs i detta protokoll utfördes på en datortomograf för små gnagare (se Materialförteckning). CT-systemet utför en spiralskanning och kan ge bilder med 100 μm upplösning. Den arbetar mellan 35-80 kVp och 10-500 μA rörström. CT-datainsamlingen varar 7-10 minuter per skanning och rekonstrueras genom en bildrymdsrekonstruktionsalgoritm (ISRA) med 100 μm rumslig upplösning. CT-avbildning utförs med hjälp av följande parametrar: i) högupplöst protokoll vid 50 kVp för WB-skanningar och ii) högupplöst multirotation lokal skanning vid 50 kVp för lokala leverskanningar. Alla parametrar ställs in i skanningsenhetens programvara (se Materialtabell) som medföljer systemet genom att följa instruktionerna i användargränssnittet. Rekonstruktionen utförs genom en Feldkamp, Davis och Kress (FDK) algoritm med en voxelstorlek på 0,1 mm. CT-artefakter minimeras genom att regelbundet kalibrera detektorerna och underhålla systemet väl genom lämpliga tjänster. Om artefakter uppstår kan den problematiska detektorn som orsakar ringartefakten avbrytas på distans och bilden korrigeras.
Det beskrivna tekniska protokollet optimerades med hjälp av kontrastmedlen eXIA och ExiTron, som valdes på grund av deras speciella formuleringar och temporala biokinetik i de olika vävnaderna. eXIA är ett helt biologiskt nedbrytbart kontrastmedel som innehåller 160 mg/ml jod som röntgendämpande medel. När detta kontrastmedel har injicerats intravenöst visar det blodets uppehållstid (med en halveringstid på >30 minuter) och tas sedan upp av metaboliskt aktiva organ som lever, mjälte, hjärtmuskel och brun fettvävnad. Det första kontrastmedlet är därför lämpligt för icke-invasiv in vivo-detektion av lever- och mjältavvikelser, hjärtinfarkt och kardiomyopati, samt för att identifiera och kvantifiera aktiv brun fettvävnad. ExiTron är ett alkaliskt jordartsmetallbaserat nanopartikelkontrastmedel med ~12 000 HU outspädd densitet42, som är speciellt framtaget för preklinisk CT-avbildning. Vid intravenös injektion cirkulerar det andra kontrastmedlet i blodomloppet, och det tas upp av cellerna i retikuloendotelsystemet43, inklusive makrofager i levern.
Det finns vissa begränsningar förknippade med den föreslagna metoden. För att detta protokoll ska lyckas bör ingen CT-signal detekteras från det första kontrastmedlet innan det andra kontrastmedlet administreras. Den tidsram som föreslogs i detta protokoll valdes efter optimeringsexperiment (och baserat på andra studier)44, som tydde på att det första kontrastmedlet har långsam clearance. Eftersom det andra kontrastmedlet har en ännu långsammare clearance-frekvens45,46 måste det administreras andra gången efter fullständig eliminering av det första kontrastmedlet. Vi har konstaterat att clearance av det första kontrastmedlet är tillfredsställande efter 12 dagars injektion. Beroende på varaktigheten av den djurmodell som används kan denna tidsskala göra det möjligt att jämföra två tidpunkter då leversjukdomen kan ha utvecklats. Med tanke på att utfodringsprotokollet som används här tar 22 veckor, förväntas en tidsfördröjning på 12 dagar inte orsaka signifikanta förändringar i sjukdomsprogressionen. Experimentatorn måste utföra lämplig validering och optimering innan det föreslagna avbildningsprotokollet justeras. Man måste också bedöma kostnads-nyttoanalysen av förloppet och bildsignalen innan man ändrar typen och koncentrationen av de kontrastmedel som används, liksom tidsramen för administreringen.
Dessutom kan båda kontrastmedlen endast tolereras upp till en viss total administreringsvolym innan de når toxiska nivåer för djuret43. På grund av det faktum att en maximal kontrastmedelsvolym krävs för att säkerställa optimal kontrast, i kombination med den långsamma reningshastigheten för medlen, föreslås en engångsinjektion för denna analys. Upprepad administrering av dessa eller andra lämpliga alternativa kontrastmedel kan också användas för olika experiment, så länge som den totala volymen av kontrastmedlet ligger under den rekommenderade gränsen vid en given tidpunkt. Ett annat krav för framgångsrik avbildning med detta mikro-CT-protokoll är korrekt administrering av kontrastmedlen. Som anges i protokollet bör försöksledaren säkerställa en långsam infusion av medlet i lämplig dos direkt i blodomloppet genom venen, utan bubblor. Om du inte gör det äventyras bildupplösningen och utgångarna. Valet av en optimal dosering och lämpliga administreringsmetoder (infusion och varaktighet mellan olika läkemedel) minskar därför risken för toxicitet och de tillhörande begränsningarna vid CT-avbildning.
För skanning vid flera tidpunkter bör uppmärksamhet ägnas åt att hålla anestesitiden så kort som möjligt. Eftersom datortomografi bara tar några minuter att genomföra kan anestesin vändas mellan vissa skanningar för att minimera risken i samband med förlängd anestesitid. Upprepad anestesiinduktion har också risker. Att placera djuren på en uppvärmd dyna mellan skanningarna och säkerställa tillräcklig vätsketillförsel hjälper dock till med återhämtningen och upprätthållandet av fysiologin. Dessutom är exponeringen för joniserande strålning som avges av röntgenstrålar tillräcklig för att påverka organ- och cellbiologin, vilket gör detta potentiellt skadligt för djuren och följaktligen resulterar i partiska och vilseledande experimentella data22. Eftersom den förväntade dosen som ska levereras per skanning är cirka 385 mGy, kan möss som får flera skanningar under studien få upp till 1,8 Gy eller mer. Detta är en betydande stråldos för möss som kan ha potentiellt skadliga effekter på deras vävnadsbiologi. Detta är särskilt oroande eftersom en ökning av dosen krävs när man minskar det isotropa voxelavståndet samtidigt som man bibehåller samma bildkvalitet22.
När det gäller efterbehandling av bilder med hjälp av den rekommenderade programvaran (se Materialförteckning) skapas segmenteringsmasker med hjälp av en blandning av regionväxande och tröskelverktyg, och detta är det mest tidskrävande steget i analysen. I vissa fall bör manuella modifieringar av de erhållna segmenteringarna utföras med hjälp av en utjämningsmetod. För att optimera kantbevarande och brusreducerande egenskaper för det önskade nätverket rekommenderar vi ett Gaussiskt filter med värdet 0,3. Representativa bilder av ett sådant vaskulärt nätverk visas i figur 6 (efterbehandlade med hjälp av en öppen DICOM-medicinsk bildvisare). Den viktigaste begränsningen när det gäller att mäta det vaskulära nätverket är att programvaran inte har förmågan att exakt separera den valda definierade ROI (som representerar leverns vaskulära nätverk) från bakgrunden (som representerar den omgivande levervävnaden); Därför måste lämplig tröskel väljas genom försök och misstag. Inledningsvis definierar användaren ett lägre tröskelvärde på 600 HE och högst 10 000 HU. Om det extraherade kärlnätverket och separationen från den omgivande vävnaden inte är acceptabla, justeras det lägre värdet genom försök och misstag efter stegvisa förändringar på 50-100 HU. Processen upprepas av användaren tills det vaskulära nätverket är tillräckligt separerat från vävnaden.
Sammanfattningsvis kan förståelse av anpassningarna av det hepatiska vaskulära nätverket under NAFLD-progression och korrelera dem med andra metoder för sjukdomskarakterisering med hjälp av den föreslagna metoden bana väg för etablering av nya, mer effektiva och reproducerbara metoder för NAFLD-forskning på möss. Detta protokoll förväntas också uppgradera värdet av prekliniska djurmodeller för att undersöka utvecklingen av nya terapier mot sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Figur 1 skapades med BioRender.com. Detta arbete stöddes av Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 till A.C.). Anna Hadjihambi är finansierad av Roger Williams Institute of Hepatology, Foundation for Liver Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
