Demonstratie van de DNA-vezeltest voor het onderzoeken van DNA-schade en reparatiedynamiek geïnduceerd door nanodeeltjes
Summary
De methodologie helpt bij de analyse van variatie in DNA-replicatiedynamiek in de aanwezigheid van nanodeeltjes. Verschillende methodologieën kunnen worden aangenomen op basis van het cytotoxiciteitsniveau van het materiaal van belang. Daarnaast wordt een beschrijving van de beeldanalyse gegeven om te helpen bij DNA-vezelanalyse.
Abstract
Blootstelling aan nanomaterialen kan replicatiestress en genomische instabiliteit in cellen veroorzaken. De mate van instabiliteit hangt af van de chemie, grootte en concentratie van de nanomaterialen, het tijdstip van blootstelling en het blootgestelde celtype. Verschillende gevestigde methoden zijn gebruikt om op te helderen hoe endogene/exogene agentia de wereldwijde replicatie beïnvloeden. Testen op repliconniveau, zoals de DNA-vezeltest, zijn echter noodzakelijk om te begrijpen hoe deze middelen de replicatie-initiatie, beëindigingen en replicatievorkprogressie beïnvloeden. Als je dit weet, kan men beter begrijpen hoe nanomaterialen de kans op mutatiefixatie en genomische instabiliteit vergroten. We gebruikten RAW 264.7-macrofagen als modelcellen om de replicatiedynamiek onder blootstelling aan grafeenoxide nanodeeltjes te bestuderen. Hier demonstreren we het basisprotocol voor de DNA-vezeltest, waaronder pulslabeling met nucleotide-analogen, cellyse, het verspreiden van de pulsgelabelde DNA-vezels op dia’s, fluorescerende immunostaining van de nucleotide-analogen in de DNA-vezels, beeldvorming van de replicatie-tussenproducten in de DNA-vezels met behulp van confocale microscopie en replicatie-intermediaire analyse met behulp van een computerondersteunde scoring en analyse (CASA) -software.
Introduction
Tijdens elke celcyclus zorgt DNA-replicatie voor nauwkeurige genoomduplicatie1. Eukaryote chromosomale replicatie hangt in wezen af van drie factoren: de timing van het afvuren van meerdere replicatieoorsprongen, de snelheid van de vorken die uit de gebakken oorsprong komen en de beëindiging van het replicatieproces wanneer twee replicatievorken van aangrenzende oorsprong elkaar ontmoeten2. Voor de high-fidelity overdracht van genetische informatie naar dochtercellen, evenals het behoud van genetische integriteit, is nauwkeurige DNA-replicatie cruciaal. Middelen die zich ontwikkelen uit een regelmatig metabolisme of te wijten zijn aan kunstmatige of natuurlijke omgevingsmaterialen vallen het genoom voortdurend aan. Deze endogene en exogene agentia zorgen ervoor dat replicatievorken vertragen of stoppen als gevolg van het tegenkomen van DNA-schade veroorzaakt door deze middelen, en de vorken die tijdelijk vertragen of stoppen als reactie op deze problemen wordt replicatiestressgenoemd 3. Als reactie op replicatiestress hebben cellen verschillende moleculaire routes ontwikkeld die de stabiliteit van de verstoorde replicatievorken behouden en hen in staat stellen opnieuw op te starten4. In termen van genetische stabiliteit, celoverleving en menselijke ziekte, zijn deze replicatiestressresponsmechanismen naar voren gekomen als de belangrijkste factoren voor het behoud van een gezond genoom, het waarborgen van celoverleving en het verminderen van de kans op ziektevorming5.
Een van de exogene agentia die replicatiestress kunnen produceren, zijn nanodeeltjes. Nanodeeltjes zijn deeltjes die in grootte variëren van 1 nm tot 100 nm6. Vanwege hun grote oppervlakken, onderscheidende vormen en unieke chemische eigenschappen worden nanodeeltjes gebruikt in verschillende medische, farmaceutische, milieu- en industriële toepassingen 7,8. Hoewel nanodeeltjes veel potentiële voordelen hebben, kunnen sommige (vanwege hun erfelijke aard of levensduur) giftig worden. Nanodeeltjes kunnen zich ook vormen als gevolg van de natuurlijke slijtage van medische implantaten en worden vrijgegeven in het peri-prothetische gebied 9,10.
Vanwege de blootstelling van mensen aan een groot aantal nanodeeltjes geproduceerd voor verschillende toepassingen, is het onderzoek op het gebied van nanodeeltjestoxiciteit de afgelopen 10 jaar enorm toegenomen11. Hoewel deze onderzoeksinspanningen informatie in overvloed hebben onthuld over de potentiële bedreiging die nanodeeltjes vormen voor de menselijke gezondheid, is de kennis over het potentieel voor nanodeeltjes om genotoxiciteit te veroorzaken nog steeds beperkt. Wat tot nu toe is ontdekt, is dat deze nanodeeltjes fysiek kunnen interageren met het DNA, DNA-schade kunnen bevorderen en de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het repareren of repliceren van DNA kunnen beschadigen of verstoren12. Om te detecteren hoe ze interfereren met DNA-replicatie, worden DNA-vezelkammen, radioresistente DNA-synthese (RDS) en DNA-vezelanalyse meestal gebruikt13,14,15,16.
De DNA-vezelkammethode is flexibel en geeft informatie over replicatievorkdynamica op het single-molecule niveau17. In wezen wordt een verzilte coverslip voorzichtig uit de DNA-oplossing getrokken zodra het DNA zich eraan bindt. De DNA-moleculen worden rechtgetrokken en uitgelijnd door de meniscus van de oplossing. De homogeniteit, afstand en uitlijning van de DNA-vezels ondersteunen nauwkeurige en betrouwbare vezelkanaallengtemetingen. Door de lengte en volgorde van de behandelingen en de medicijnen die worden gebruikt om stress of schade te veroorzaken aan te passen, kunnen veel aspecten van de vorkvoortgang worden gevolgd met behulp van deze applicatie. Bij deze methode wordt een dubbel labelsysteem gebruikt, waarmee de snelheid en progressie van de replicatievork worden beoordeeld17,18. Aan de andere kant maakt 2D-gel-elektroforese gebruik van het feit dat, bij agarose-gel-elektroforese, vertakkende DNA-structuren langzamer reizen dan lineaire DNA-moleculen van dezelfde massa, waardoor de twee in een 2D-run kunnen worden gescheiden. In feite wordt deze methode onderzocht om DNA-moleculen te scheiden op basis van hun massa in de eerste run en op basis van hun vorm in de tweede orthogonale run. Na genomische DNA-fragmentatie ontwikkelen de ongewone replicatie- en recombinatietussenproducten een vertakkende vorm en kunnen ze worden onderscheiden van de meer gebruikelijke lineaire moleculen in de 2D-gel19.
De RDS-methode wordt gebruikt om te bepalen hoe de wereldwijde DNA-synthese wordt beïnvloed. Bij deze methode wordt de mate van remming van globale replicatie bepaald door de hoeveelheid geïncorporeerde radioactief gelabelde nucleotiden, zoals [14C] thymidine, in onbehandelde versus behandelde cellen te vergelijken14,20. Het procentuele verschil in radiolabeling tussen de onbehandelde en behandelde cellen vertegenwoordigt de mate waarin het DNA-beschadigende agens de DNA-synthese beïnvloedt. Vergelijkbaar hiermee gebruikt een andere methode het vermogen van cellen om nucleotide-analogen zoals BrdU (5-broom-2′-deoxyuridine) te integreren voor flowcytometrie om de totale snelheden van DNA-synthese te meten21,22. Hoewel deze methoden aantonen hoe DNA-beschadigende stoffen de wereldwijde DNA-synthese beïnvloeden, laten ze niet zien hoe individuele replicons worden beïnvloed. Inderdaad, replicon-niveau assays zijn noodzakelijk om de initiatie en omvang van genomische instabiliteit in het geval van blootstelling aan toxische deeltjes (nanomateriaal) beter te begrijpen. DNA-vezelautoradiografie en elektronenmicroscopie zijn enkele methoden die worden gebruikt om deze23,24,25,26 te bepalen.
De concepten van replicatiebellen en bidirectionele replicatie van ongelijk verdeelde bronnen werden voor het eerst ontwikkeld met behulp van single-molecule tests zoals elektronenmicroscopie en DNA-vezelautoradiografie27,28. De directe waarneming van vertakkende replicatie-tussenproducten op specifieke moleculen verspreid over een met koolstof bedekt raster wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door elektronenmicroscopie. Deze methode, die vandaag de dag nog steeds wordt gebruikt om pathologische verschuivingen bij replicatievorken te volgen, werd gebruikt om de eerste eukaryote oorsprong van DNA-replicatiete lokaliseren 28. Vezelautoradiografie is gecentreerd rond het concept van de autoradiografische identificatie van nieuw gerepliceerde gebieden en de pulslabeling van chromosomen met tritiated thymidine. De eerste kwantitatieve evaluatie van oorsprongsdichtheden en replicatievorksnelheden in metazoaire genomische sequenties werd mogelijk gemaakt door DNA-vezelautoradiografie29.
Momenteel hebben vezelfluorografiemethoden de plaats ingenomen van autoradiografie, vooral omdat vezelfluorografie veel sneller is dan autoradiografie. In vezelfluorografie worden twee gehalogeneerde nucleotidederivaten, zoals broom- (Br), chloor- (Cl) of iododeoxyuridine (IdU), achtereenvolgens opgenomen in vers gerepliceerd DNA en vervolgens geïdentificeerd door indirecte immunofluorescentie met behulp van antilichamen30. Microscopisch kijken van het ontluikende DNA dat een of beide analogen heeft opgenomen, wordt mogelijk gemaakt door immunostaining van een van de analogen in één kleur en de andere analoog in een andere kleur (bijvoorbeeld immunostaining nascent DNA met opgenomen IdU-rood en opgenomen CldU-groen) (figuur 1) 21. Veel verschillende soorten replicatie-tussenproducten kunnen worden geïdentificeerd door DNA-vezelanalyse. De meest bestudeerde zijn individuele rekvorken, initiaties en beëindigingen. Individuele langwerpige vorken hebben een replicatiepatroon van rood gevolgd door groen (rood-groen; Figuur 2A). 13 De lengtes van deze tussenproducten worden vaak gebruikt om de vorksnelheid (d.w.z. vorklengte/pulstijd) of de exonucleolytische afbraak van ontluikend DNA door spoorverkorting te meten (figuur 2E)30,31,32. In een studie van Mimitou et al. werd gevonden dat bij langdurige blootstelling aan hydroxyurea, een replicatiegif dat dubbelstrengsbreuken in het DNA veroorzaakt, RE11 werd gerekruteerd33. MRE11 is een exonuclease die bekend staat om zijn 3′-5′ exonuclease-activiteit en het is in staat om de uiteinden van DNA te knippen voor reparatie. Daarom kan men bij blootstelling aan toxische agentia exonucleolytische afbraak van ontluikend DNA waarnemen, wat de verkorting van de DNA-streng is als gevolg van blootstelling aan een DNA-beschadigend agens34.
Replicatievorkbreuken veroorzaakt door fysieke obstructies (DNA-eiwitcomplexen of DNA-laesies), chemische belemmeringen of mutaties kunnen de replicatie stoppen en homologe recombinatie vereisen om het opnieuw op te starten. Dit staat bekend als verminderde vorkprogressie. Talrijke in vitro en in vivo onderzoeken hebben aangetoond dat transcriptie soms de vooruitgang van replicatievorken op deze manier kan voorkomen35.
Inwijdingen zijn replicatie-oorsprongen die initiëren en vuren tijdens de eerste of tweede puls. Oorsprongen die tijdens de eerste puls vuren en replicatievorken hebben die actief blijven, hebben een groen-rood-groen patroon (figuur 2B, lager). Oorsprongen die tijdens de tweede puls initiëren, hebben een groen-only patroon (figuur 2B, boven) en worden soms nieuw geïnitieerde oorsprongen genoemd, zodat die oorsprongen kunnen worden onderscheiden van die welke tijdens de eerste puls worden geïnitieerd. De vergelijking van de relatieve percentages van nieuw afgevuurde oorsprong tussen twee experimentele omstandigheden maakt het mogelijk om te begrijpen hoe een cel reageert op een DNA-beschadigend agens of de aan- of afwezigheid van een eiwit. Beëindigingen worden gemaakt wanneer twee replicatievorken van aangrenzende replicons samensmelten en ze een rood-groen-rood patroon hebben (figuur 2D)30.
Op basis van de hierboven beschreven feiten wordt DNA-vezelanalyse momenteel beschouwd als een voorkeursmethode om de variatie in DNA-replicatiedynamiek veroorzaakt door toxische stoffen zoals nanomaterialen te bestuderen. Onderzoekers hebben nu een goed begrip en kennis van de dynamiek van genoombrede DNA-replicatie in eukaryoten, zowel kwantitatief als kwalitatief, dankzij de ontdekking van deze technologie36. Op basis van de uitkomstvariabelen kunnen verschillende methodieken worden gehanteerd. Enkele voorbeelden van methoden om de variaties in DNA-schade veroorzaakt door externe agentia/nanodeeltjes te bestuderen, zijn weergegeven in figuur 3. Het algemene doel van de DNA-vezelanalysemethode die in deze studie wordt beschreven, is om te bepalen hoe nanodeeltjes het replicatieproces in vitro beïnvloeden en hoe ze differentieel verschillende weefsels beïnvloeden.
Protocol
Representative Results
Discussion
We bespreken hier een methode om te helpen bij de analyse van de variatie in DNA-replicatiedynamiek in de aanwezigheid van nanodeeltjes via de DNA-vezeltest. Belangrijke kritische stappen in de standaardtest worden beschreven in het protocol (stap 2.2.2 en stap 3.1.3). Het wordt altijd aanbevolen om een gebied te gebruiken met beperkte blootstelling aan bovenlicht en een constante luchtstroom om door licht geïnduceerde DNA-breuken in de dia’s te voorkomen en de reproduceerbaarheid te verbeteren. Zorgvuldige aandacht is …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen financiële steun van de Blazer-stichting, het Medical Biotechnology Program bij Biomedical Sciences, UIC Rockford en het Department of Health Science Education, UIC Rockford. De auteurs bedanken Ananya Sangineni en James Bradley voor hun bijdragen aan het project.
Materials
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Recherche en cancérologie. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
