JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

DNA Hasarını Araştırmak ve Nanopartiküllerin İndüklediği Onarım Dinamiklerini Araştırmak için DNA Fiber Testinin Gösterilmesi

Published: March 03, 2023
doi:
10.3791/64903
, ,
1Department of Biomedical Sciences,University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education,University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Abstract

Nanomalzeme maruziyeti, hücrelerde replikasyon stresine ve genomik kararsızlığa neden olabilir. Kararsızlık derecesi, nanomalzemelerin kimyasına, boyutuna ve konsantrasyonuna, maruz kalma süresine ve maruz kalan hücre tipine bağlıdır. Endojen / eksojen ajanların küresel replikasyonu nasıl etkilediğini aydınlatmak için çeşitli yerleşik yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, DNA lifi testi gibi replikon seviyesi tahliller, bu ajanların replikasyon başlangıcını, sonlandırmalarını ve replikasyon çatalı ilerlemesini nasıl etkilediğini anlamak için zorunludur. Bunu bilmek, nanomalzemelerin mutasyon fiksasyonu ve genomik kararsızlık şansını nasıl artırdığını daha iyi anlamamızı sağlar. Grafen oksit nanopartikül maruziyeti altındaki replikasyon dinamiklerini incelemek için model hücreler olarak RAW 264.7 makrofajlarını kullandık. Burada, nükleotid analogları ile nabız etiketleme, hücre lizisi, nabız etiketli DNA liflerinin slaytlara yayılması, DNA lifleri içindeki nükleotid analoglarının floresan immünoboyanması, konfokal mikroskopi kullanılarak DNA lifleri içindeki replikasyon ara ürünlerinin görüntülenmesi ve bilgisayar destekli bir puanlama ve analiz (CASA) yazılımı kullanılarak replikasyon ara analizini içeren DNA lifi testi için temel protokolü gösteriyoruz.

Introduction

Her hücre döngüsü sırasında, DNA replikasyonu doğru genom duplikasyonu sağlar1. Ökaryotik kromozomal replikasyon esas olarak üç faktöre bağlıdır: çoklu replikasyon orijinlerinin ateşlenmesinin zamanlaması, ateşlenen orijinlerden çıkan çatalların hızı ve bitişik orijinlerden iki replikasyon çatalı2 ile buluştuğunda replikasyon işleminin sona ermesi. Genetik bilginin yavru hücrelere yüksek doğrulukta aktarılması ve genetik bütünlüğün korunması için, doğru DNA replikasyonu çok önemlidir. Düzenli metabolizmadan gelişen veya yapay veya doğal çevresel materyallerden kaynaklanan ajanlar sürekli olarak genoma saldırmaktadır. Bu endojen ve eksojen ajanlar, bu ajanların neden olduğu DNA hasarı ile karşılaşmaları nedeniyle replikasyon çatallarının yavaşlamasına veya durmasına neden olur ve bu zorluklara yanıt olarak geçici olarak yavaşlayan veya duran çatallara replikasyon stresi3 denir. Replikasyon stresine yanıt olarak, hücreler rahatsız edici replikasyon çatallarının stabilitesini koruyan ve yeniden başlatmalarına izin veren birkaç moleküler yol geliştirmiştir4. Genetik stabilite, hücre sağkalımı ve insan hastalığı açısından, bu replikasyon stres yanıt mekanizmaları, sağlıklı bir genomun korunması, hücre sağkalımının sağlanması ve hastalık oluşum olasılığının azaltılması için anahtar faktörler olarak ortaya çıkmıştır5.

Replikasyon stresi üretebilen eksojen ajanlardan biri nanopartiküllerdir. Nanopartiküller, boyutları 1 nm ila 100 nm6 arasında değişen parçacıklardır. Yüksek yüzey alanları, ayırt edici şekilleri ve benzersiz kimyasal özellikleri nedeniyle, nanopartiküller çeşitli tıbbi, farmasötik, çevresel ve endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadır 7,8. Nanopartiküllerin birçok potansiyel faydası olsa da, bazıları (kalıtsal doğaları veya uzun ömürlülükleri nedeniyle) toksik hale gelebilir. Nanopartiküller ayrıca tıbbi implantların doğal aşınması ve yıpranması nedeniyle oluşabilir ve peri-protez bölgesine salınabilir 9,10.

İnsanların çeşitli uygulamalar için üretilen sayısız nanopartiküle maruz kalması nedeniyle, nanopartikül toksisitesi alanındaki araştırmalar son 10 yılda muazzam bir şekilde artmıştır11. Bu araştırma çabaları, nanopartiküllerin insan sağlığına oluşturduğu potansiyel tehdit hakkında bol miktarda bilgi ortaya çıkarmış olsa da, nanopartiküllerin genotoksisiteye neden olma potansiyeli hakkındaki bilgiler hala sınırlıdır. Şimdiye kadar keşfedilen şey, bu nanopartiküllerin DNA ile fiziksel olarak etkileşime girebileceği, DNA hasarını teşvik edebileceği ve DNA12’nin onarılmasından veya çoğaltılmasından sorumlu proteinlere zarar verebileceği veya müdahale edebileceğidir. DNA replikasyonuna nasıl müdahale ettiklerini tespit etmek için, DNA lifi taraması, radyorezistanslı DNA sentezi (RDS) ve DNA lifi analizi tipik olarak 13,14,15,16 kullanılır.

DNA lifi tarama yöntemi esnektir ve tek molekül seviyesi17’de replikasyon çatal dinamikleri hakkında bilgi verir. Özünde, tuzlanmış bir örtü kayması, DNA sona erdiğinde DNA çözeltisinden yavaşça çekilir. DNA molekülleri, çözeltinin menisküsü tarafından düzleştirilir ve hizalanır. DNA liflerinin homojenliği, aralığı ve hizalaması, doğru ve güvenilir lif yolu uzunluğu ölçümlerini destekler. Tedavilerin uzunluğunu ve sırasını ve stres veya hasara neden olmak için kullanılan ilaçları ayarlayarak, çatal ilerlemesinin birçok yönü bu uygulama kullanılarak izlenebilir. Bu yöntemde, replikasyon çatalının hızının ve ilerlemesinin değerlendirildiği bir çift etiketleme sistemi kullanılır17,18. Öte yandan, 2D jel elektroforezi, agaroz jel elektroforezinde, dallanan DNA yapılarının aynı kütlenin doğrusal DNA moleküllerinden daha yavaş hareket etmesi ve ikisinin 2D bir çalışmada temiz bir şekilde ayrılmasına izin vermesi gerçeğinden yararlanır. Aslında, bu yöntem, DNA moleküllerini ilk çalışmada kütlelerine göre ve ikinci ortogonal çalışmada şekillerine göre ayırmak için araştırılmıştır. Genomik DNA parçalanmasından sonra, nadir replikasyon ve rekombinasyon ara ürünleri dallanma formu geliştirir ve 2D jel19’daki daha yaygın doğrusal moleküllerden ayırt edilebilirler.

RDS yöntemi, küresel DNA sentezinin nasıl etkilendiğini belirlemek için kullanılır. Bu yöntemde, küresel replikasyonun inhibisyon derecesi, [14C] timidin gibi radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleotidlerin miktarının, tedavi edilmemiş hücrelere karşı14,20 ile karşılaştırılmasıyla belirlenir. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler arasındaki radyoetiketlemedeki yüzde farkı, DNA’ya zarar veren ajanın DNA sentezini etkileme derecesini temsil eder. Buna benzer şekilde, başka bir yöntem, hücrelerin DNA sentezi21,22’nin genel oranlarını ölçmek için akış sitometrisi için BrdU (5-bromo-2′-deoksiüridin) gibi nükleotid analoglarını entegre etme yeteneğini kullanır. Bu yöntemler, DNA’ya zarar veren ajanların küresel DNA sentezini nasıl etkilediğini gösterirken, bireysel replikonların nasıl etkilendiğini göstermez. Gerçekten de, replikon seviyesi tahlilleri, toksik parçacık (nanomalzeme) maruziyeti durumunda genomik instabilitenin başlangıcını ve kapsamını daha iyi anlamak için zorunludur. DNA fiber otoradyografisi ve elektron mikroskobu bu 23,24,25,26’yı belirlemek için kullanılan bazı yöntemlerdir.

Eşit aralıklı olmayan kaynaklardan replikasyon kabarcıkları ve çift yönlü replikasyon kavramları ilk olarak elektron mikroskobu ve DNA fiber otoradyografi27,28 gibi tek moleküllü testler kullanılarak geliştirilmiştir. Dallanma replikasyon ara ürünlerinin karbon kaplı bir ızgaraya dağılmış spesifik moleküller üzerinde doğrudan gözlemlenmesi, elektron mikroskobu ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Replikasyon çatallarındaki patolojik kaymaları izlemek için bugün hala kullanılmakta olan bu yöntem, DNA replikasyonu28’in ilk ökaryotik kökenini bulmak için kullanılmıştır. Fiber otoradyografi, yeni çoğalan alanların otoradyografik olarak tanımlanması ve tritiye timidin ile kromozomların nabız etiketlemesi kavramı etrafında toplanmıştır. Metazoan genomik sekanslarda orijin yoğunluklarının ve replikasyon çatal oranlarının ilk kantitatif değerlendirmesi DNA fiber otoradyografisi29 ile mümkün olmuştur.

Şu anda, fiber florografi yöntemleri otoradyografinin yerini almıştır, çünkü fiber florografi otoradyografiden çok daha hızlıdır. Fiber florografide, bromo- (Br), kloro- (Cl) veya iyododeoksiüridin (IdU) gibi iki halojenli nükleotid türevi, yeni çoğaltılmış DNA’ya sırayla dahil edilir ve daha sonra antikorlar30 kullanılarak dolaylı immünofloresan ile tanımlanır. Bir veya her iki analogu da içeren yeni ortaya çıkan DNA’nın mikroskobik görünümü, analoglardan birinin bir renkte, diğer analogun farklı bir renkte immünoboyanmasıyla mümkün olur (örneğin, yeni ortaya çıkan DNA’nın IdU kırmızısı ve CldU yeşili ile immünoboyaması ile boyanır) (Şekil 1)21. DNA lifi analizi ile birçok farklı replikasyon ara ürünü türü tanımlanabilir. En yaygın olarak çalışılan bireysel uzatılmış çatallar, inisiyasyonlar ve sonlandırmalardır. Tek tek uzatılmış çatallar, kırmızı ve ardından yeşil (kırmızı-yeşil; Şekil 2A). 13 Bu ara ürünlerin uzunlukları, çatal hızını (yani, çatal uzunluğu / darbe süresi) veya yeni ortaya çıkan DNA’nın ekzonkleolitik bozulmasını iz kısaltması yoluyla ölçmek için sıklıkla kullanılır (Şekil 2E)30,31,32. Mimitou ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, DNA’da çift iplikçik kırılmalarına neden olan bir replikasyon zehiri olan hidroksiüreye uzun süreli maruz kaldıktan sonra, RE11’in33 işe alındığı bulunmuştur. MRE11, 3′-5′ ekzonükleaz aktivitesi ile bilinen bir ekzonükleazdır ve onarım için DNA’nın uçlarını kesebilir. Bu nedenle, toksik ajanlara maruz kaldığında, DNA’ya zarar veren bir ajana maruz kalma nedeniyle DNA ipliğinin kısalması olan yeni ortaya çıkan DNA’nın ekzonkleolitik bozulması gözlemlenebilir34.

Fiziksel engellerin (DNA-protein kompleksleri veya DNA lezyonları), kimyasal engellerin veya mutasyonların neden olduğu replikasyon çatalı kırılmaları, replikasyonu durdurabilir ve yeniden başlatmak için homolog rekombinasyon gerektirebilir. Bu, bozulmuş çatal ilerlemesi olarak bilinir. Çok sayıda in vitro ve in vivo araştırma, transkripsiyonun zaman zaman replikasyon çatalının bu şekilde ilerlemesini önleyebileceğini göstermiştir35.

İnisiyasyonlar, birinci veya ikinci darbe sırasında başlayan ve ateşlenen replikasyon kökenleridir. İlk darbe sırasında ateşlenen ve aktif olmaya devam eden replikasyon çatallarına sahip orijinler yeşil-kırmızı-yeşil bir desene sahiptir (Şekil 2B, daha düşük). İkinci nabız sırasında başlayan orijinler sadece yeşil bir kalıba sahiptir (Şekil 2B, üstte) ve bazen yeni başlatılan orijinler olarak adlandırılır, bu nedenle bu orijinler ilk nabız sırasında başlayanlardan ayırt edilebilir. İki deneysel koşul arasında yeni ateşlenen kökenlerin göreceli yüzdelerinin karşılaştırılması, bir hücrenin DNA’ya zarar veren bir ajana veya bir proteinin varlığına veya yokluğuna nasıl tepki verdiğini anlamayı sağlar. Sonlandırmalar, bitişik replikonlardan iki çoğaltma çatalı birleştiğinde oluşturulur ve kırmızı-yeşil-kırmızı bir desene sahiptirler (Şekil 2D)30.

Yukarıda açıklanan gerçeklere dayanarak, DNA lifi analizi şu anda nanomalzemeler gibi toksik ajanların neden olduğu DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonu incelemek için tercih edilen bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Araştırmacılar artık bu teknolojinin keşfi sayesinde ökaryotlarda genom çapında DNA replikasyonunun dinamikleri hakkında hem nicel hem de nitel olarak iyi bir anlayışa ve bilgiye sahipler36. Sonuç değişkenlerine dayanarak, çeşitli metodolojiler benimsenebilir. Dış ajanlar / nanopartiküller tarafından indüklenen DNA hasarındaki varyasyonları incelemek için bazı yöntem örnekleri Şekil 3’te gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan DNA lifi analiz yönteminin genel amacı, nanopartiküllerin in vitro replikasyon sürecini nasıl etkilediğini ve çeşitli dokuları farklı şekilde nasıl etkilediklerini belirlemektir.

Protocol

1. Antikorların ve tamponun hazırlanması Birincil antikor çözeltisini, fare anti-BrdU’sunu %5 BSA’da 1:300 seyreltmede ve sıçan anti-BrdU’yu %5 BSA’da 1:500 seyreltmede hazırlayın. İkincil antikor çözeltisi olan alexafluor 594 tavşan anti-faresini %5 BSA’da 1:300 seyreltmede ve alexafluor 488 tavuk anti-faresini %5 BSA’da 1:500 seyreltmede hazırlayın. Üçüncül antikor çözeltisini, alexafluor 594 keçi anti-tavşanını %5 BSA’da 1:1.000 seyreltmede ve ale…

Representative Results

Yeterli görüntü elde edildikten sonra (koşul başına 20-100 görüntüden), çoğaltma ara ürünlerinin tanımlanması, ölçülmesi ve sayılması gerekir. Elyafların bir program38 aracılığıyla manuel veya otomatik olarak analiz edilip edilmediğini, bir elyafın sayılması veya puanlanması (veya sayılmaması veya ölçülmemesi) için hangi özelliklere sahip olması gerektiğini açıkça tanımlamak gerekir39. Örneğin, aşağıdaki sorular düş…

Discussion

Burada, DNA lifi testi yoluyla nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olacak bir yöntemi tartışıyoruz. Standart tahlilde yer alan başlıca kritik adımlar protokolde açıklanmıştır (adım 2.2.2 ve adım 3.1.3). Slaytlarda ışığa bağlı DNA kırılmalarını önlemek ve tekrarlanabilirliği artırmak için her zaman sınırlı baş üstü ışığa maruz kalma ve sürekli hava akışı olan bir alan kullanılması önerilir. Slaytlardaki hücre lizat…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Blazer vakfı, Biyomedikal Bilimler Tıbbi Biyoteknoloji Programı, UIC Rockford ve UIC Rockford Sağlık Bilimleri Eğitimi Bölümü’nden finansal destek kabul etmektedir. Yazarlar, projeye katkılarından dolayı Ananya Sangineni ve James Bradley’e teşekkür eder.

Materials

24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Recherche en cancérologie. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

Keywords: DNA Fiber AssayDNA DamageDNA RepairNanoparticlesDNA Replication DynamicsChromatin DynamicsTherapeutic AgentsNanomedicineRAW 264.5 Macrophage CellsIododeoxyuridineChloro-iododeoxyuridine
check_url/fr/64903?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image