La metodologia assiste nell’analisi della variazione nelle dinamiche di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle. Diverse metodologie possono essere adottate in base al livello di citotossicità del materiale di interesse. Inoltre, viene fornita una descrizione dell’analisi delle immagini per aiutare nell’analisi delle fibre del DNA.
L’esposizione ai nanomateriali può causare stress da replicazione e instabilità genomica nelle cellule. Il grado di instabilità dipende dalla chimica, dalle dimensioni e dalla concentrazione dei nanomateriali, dal tempo di esposizione e dal tipo di cellula esposta. Diversi metodi consolidati sono stati utilizzati per chiarire come gli agenti endogeni / esogeni influenzano la replicazione globale. Tuttavia, i saggi a livello di replica, come il test delle fibre di DNA, sono indispensabili per capire come questi agenti influenzano l’inizio della replicazione, le terminazioni e la progressione della forcella di replicazione. Sapere questo permette di capire meglio come i nanomateriali aumentino le possibilità di fissazione delle mutazioni e di instabilità genomica. Abbiamo usato macrofagi RAW 264.7 come cellule modello per studiare le dinamiche di replicazione sotto l’esposizione alle nanoparticelle di ossido di grafene. Qui, dimostriamo il protocollo di base per il test delle fibre di DNA, che include l’etichettatura degli impulsi con analoghi nucleotidici, la lisi cellulare, la diffusione delle fibre di DNA marcate con impulso su vetrini, l’immunocolorazione fluorescente degli analoghi nucleotidici all’interno delle fibre di DNA, l’imaging degli intermedi di replicazione all’interno delle fibre del DNA utilizzando la microscopia confocale e l’analisi intermedia della replica utilizzando un software di punteggio e analisi assistita da computer (CASA).
Durante ogni ciclo cellulare, la replicazione del DNA garantisce un’accurata duplicazione del genoma1. La replicazione cromosomica eucariotica dipende essenzialmente da tre fattori: la tempistica dell’attivazione di più origini di replicazione, la velocità delle forcelle che emergono dalle origini sparate e la cessazione del processo di replicazione quando due forcelle di replicazione da origini adiacenti si incontrano2. Per la trasmissione ad alta fedeltà delle informazioni genetiche alle cellule figlie, nonché per la conservazione dell’integrità genetica, è fondamentale un’accurata replicazione del DNA. Gli agenti che si sviluppano dal metabolismo regolare o sono dovuti a materiali ambientali artificiali o naturali attaccano costantemente il genoma. Questi agenti endogeni ed esogeni causano il rallentamento o l’arresto delle forcelle di replicazione a causa del danno al DNA causato da questi agenti e le forcelle che rallentano temporaneamente o si fermano in risposta a queste difficoltà sono chiamate stress di replicazione3. In risposta allo stress di replicazione, le cellule hanno sviluppato diversi percorsi molecolari che mantengono la stabilità delle forcelle di replicazione disturbate e consentono loro di ricominciare4. In termini di stabilità genetica, sopravvivenza cellulare e malattie umane, questi meccanismi di risposta allo stress di replicazione sono emersi come fattori chiave per mantenere un genoma sano, garantire la sopravvivenza cellulare e ridurre la probabilità di formazione di malattie5.
Uno degli agenti esogeni in grado di produrre stress di replicazione sono le nanoparticelle. Le nanoparticelle sono particelle di dimensioni variabili da 1 nm a 100 nm6. Grazie alle loro elevate aree superficiali, alle forme distintive e alle proprietà chimiche uniche, le nanoparticelle sono utilizzate in varie applicazioni mediche, farmaceutiche, ambientali e industriali 7,8. Mentre le nanoparticelle hanno molti potenziali benefici, alcune di esse (a causa della loro natura ereditaria o longevità) possono diventare tossiche. Le nanoparticelle possono anche formarsi a causa dell’usura naturale degli impianti medici ed essere rilasciate nella regione peri-protesica 9,10.
A causa dell’esposizione degli esseri umani a una miriade di nanoparticelle prodotte per varie applicazioni, la ricerca nel campo della tossicità delle nanoparticelle è aumentata enormemente negli ultimi 10 anni11. Mentre questi sforzi di ricerca hanno rivelato informazioni in abbondanza sulla potenziale minaccia che le nanoparticelle rappresentano per la salute umana, la conoscenza del potenziale delle nanoparticelle di causare genotossicità è ancora limitata. Ciò che è stato scoperto finora è che queste nanoparticelle possono interagire fisicamente con il DNA, promuovere danni al DNA e danneggiare o interferire con le proteine responsabili della riparazione o della replicazione del DNA12. Per rilevare come interferiscono con la replicazione del DNA, la pettinatura delle fibre del DNA, la sintesi del DNA radioresistente (RDS) e l’analisi delle fibre del DNA vengono in genere utilizzate13,14,15,16.
Il metodo di pettinatura delle fibre di DNA è flessibile e fornisce informazioni sulla dinamica della forcella di replicazione a livello di singola molecola17. In sostanza, un coprislip salinizzato viene delicatamente prelevato dalla soluzione di DNA una volta che le estremità del DNA si legano ad esso. Le molecole di DNA sono raddrizzate e allineate dal menisco della soluzione. L’omogeneità, la spaziatura e l’allineamento delle fibre di DNA supportano misurazioni accurate e affidabili della lunghezza del tratto di fibre. Regolando la lunghezza e la sequenza dei trattamenti e dei farmaci utilizzati per causare stress o danni, molti aspetti dell’avanzamento della forcella possono essere monitorati utilizzando questa applicazione. In questo metodo, viene utilizzato un doppio sistema di etichettatura, attraverso il quale vengono valutate la velocità e la progressione della forcella di replica17,18. D’altra parte, l’elettroforesi su gel 2D sfrutta il fatto che, nell’elettroforesi su gel di agarosio, le strutture di DNA ramificate viaggiano più lentamente delle molecole di DNA lineari della stessa massa, consentendo la separazione pulita dei due in una corsa 2D. Infatti, questo metodo è studiato per segregare le molecole di DNA in base alla loro massa nella prima corsa e in base alla loro forma nella seconda corsa ortogonale. Dopo la frammentazione del DNA genomico, gli intermedi di replicazione e ricombinazione non comuni sviluppano una forma ramificata e possono essere distinti dalle molecole lineari più comuni nel gel 2D19.
Il metodo RDS viene utilizzato per determinare come viene influenzata la sintesi globale del DNA. In questo metodo, il grado di inibizione della replicazione globale è determinato confrontando la quantità di nucleotidi marcati radioattivamente incorporati, come [14C] timidina, in cellule non trattate rispetto a quelle trattate14,20. La differenza percentuale nella radiomarcatura tra le cellule non trattate e trattate rappresenta il grado in cui l’agente dannoso per il DNA influisce sulla sintesi del DNA. Analogamente a questo, un altro metodo utilizza la capacità delle cellule di integrare analoghi nucleotidici come BrdU (5-bromo-2′-deossiuridina) per la citometria a flusso per misurare i tassi complessivi di sintesi del DNA21,22. Mentre questi metodi dimostrano come gli agenti dannosi del DNA influenzano la sintesi globale del DNA, non mostrano come i singoli replicons sono influenzati. In effetti, i saggi a livello di replicon sono indispensabili per comprendere meglio l’inizio e l’entità dell’instabilità genomica in caso di esposizione a particelle tossiche (nanomateriali). L’autoradiografia delle fibre del DNA e la microscopia elettronica sono alcuni metodi utilizzati per determinare questo23,24,25,26.
I concetti di bolle di replicazione e replicazione bidirezionale da sorgenti distanti in modo non uniforme sono stati inizialmente sviluppati utilizzando test a singola molecola come la microscopia elettronica e l’autoradiografia delle fibre di DNA27,28. L’osservazione diretta di intermedi di replicazione ramificati su molecole specifiche disperse attraverso una griglia rivestita di carbonio è notevolmente facilitata dalla microscopia elettronica. Questo metodo, che è ancora in uso oggi per tracciare i cambiamenti patologici alle forche di replicazione, è stato utilizzato per localizzare la prima origine eucariotica della replicazione del DNA28. L’autoradiografia a fibra è incentrata sul concetto di identificazione autoradiografica di aree di nuova replicazione e sulla marcatura del polso dei cromosomi con timidina triziata. La prima valutazione quantitativa delle densità di origine e dei tassi di forcella di replicazione nelle sequenze genomiche dei metazoi è stata resa possibile dall’autoradiografia delle fibre di DNA29.
Attualmente, i metodi di fluorografia delle fibre hanno preso il posto dell’autoradiografia, principalmente perché la fluorografia delle fibre è molto più veloce dell’autoradiografia. Nella fluorografia delle fibre, due derivati nucleotidici alogenati, come bromo- (Br), cloro- (Cl) o iododeossiuridina (IdU), sono incorporati sequenzialmente nel DNA appena replicato e quindi identificati mediante immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi30. La visione microscopica del DNA nascente che ha incorporato uno o entrambi gli analoghi è resa possibile dall’immunocolorazione di uno degli analoghi in un colore e dell’altro analogo in un colore diverso (ad esempio, immunocolorazione del DNA nascente con rosso IdU incorporato e verde CldU incorporato) (Figura 1)21. Molti diversi tipi di intermedi di replicazione possono essere identificati dall’analisi delle fibre del DNA. I più comunemente studiati sono le singole forcelle allunganti, iniziazioni e terminazioni. Le singole forcelle allunganti hanno un modello di replicazione di rosso seguito da verde (rosso-verde; Figura 2A). 13 Le lunghezze di questi intermedi sono frequentemente utilizzate per misurare la velocità della forcella (cioè la lunghezza della forcella/tempo dell’impulso) o la degradazione esonucleolitica del DNA nascente attraverso l’accorciamento della traccia (Figura 2E)30,31,32. In uno studio di Mimitou et al., è stato scoperto che dopo l’esposizione a lungo termine all’idrossiurea, un veleno di replicazione che causa rotture a doppio filamento nel DNA, RE11 è stato reclutato33. MRE11 è un’esonucleasi nota per la sua attività di esonucleasi 3′-5′ ed è in grado di tagliare le estremità del DNA per la riparazione. Pertanto, quando esposti ad agenti tossici, si può osservare la degradazione esonucleolitica del DNA nascente, che è l’accorciamento del filamento di DNA dovuto all’esposizione a un agente dannoso per il DNA34.
Le rotture della forcella di replicazione causate da ostruzioni fisiche (complessi DNA-proteina o lesioni del DNA), impedimenti chimici o mutazioni possono arrestare la replicazione e richiedere una ricombinazione omologa per riavviarla. Questo è noto come progressione della forcella compromessa. Numerose indagini in vitro e in vivo hanno indicato che la trascrizione può, occasionalmente, impedire l’avanzamento della forcella di replicazione de questo modo35.
Le iniziazioni sono origini di replica che iniziano e si attivano durante il primo o il secondo impulso. Le origini che si attivano durante il primo impulso e hanno forcelle di replica che continuano ad essere attive hanno un pattern verde-rosso-verde (Figura 2B, in basso). Le origini che iniziano durante il secondo impulso hanno un modello solo verde (Figura 2B, in alto) e sono talvolta chiamate origini appena iniziate, quindi quelle origini possono essere differenziate da quelle che iniziano durante il primo impulso. Il confronto delle percentuali relative di origini appena cotte tra due condizioni sperimentali permette di capire come una cellula risponde a un agente dannoso per il DNA o la presenza o l’assenza di una proteina. Le terminazioni vengono create quando due fork di replica da replicons adiacenti si uniscono e hanno un pattern rosso-verde-rosso (Figura 2D)30.
Sulla base dei fatti sopra descritti, l’analisi delle fibre di DNA è attualmente considerata un metodo preferito per studiare la variazione delle dinamiche di replicazione del DNA causata da agenti tossici come i nanomateriali. I ricercatori hanno ora una buona comprensione e conoscenza delle dinamiche della replicazione del DNA a livello di genoma negli eucarioti, sia quantitativamente che qualitativamente, grazie alla scoperta di questa tecnologia36. Sulla base delle variabili di risultato, possono essere adottate diverse metodologie. Alcuni esempi di metodi per studiare le variazioni del danno al DNA indotto da agenti esterni/nanoparticelle sono mostrati nella Figura 3. L’obiettivo generale del metodo di analisi delle fibre di DNA descritto in questo studio è determinare come le nanoparticelle influenzano il processo di replicazione in vitro e come influenzano de modo differenziale i vari tessuti.
Discutiamo qui un metodo per aiutare nell’analisi della variazione nella dinamica di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle attraverso il saggio delle fibre di DNA. I principali passaggi critici coinvolti nel test standard sono descritti nel protocollo (fase 2.2.2 e fase 3.1.3). Si consiglia sempre di utilizzare un’area con un’esposizione limitata alla luce dall’alto e un flusso d’aria costante per prevenire rotture del DNA indotte dalla luce nei vetrini e per migliorare la riproducibilità. È necessaria un’…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della fondazione Blazer, del Medical Biotechnology Program di Biomedical Sciences, UIC Rockford e del Department of Health Science Education, UIC Rockford. Gli autori ringraziano Ananya Sangineni e James Bradley per il loro contributo al progetto.
24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |