पद्धति नैनोकणों की उपस्थिति में डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता के विश्लेषण में सहायता करती है। रुचि की सामग्री के साइटोटॉक्सिसिटी स्तर के आधार पर विभिन्न पद्धतियों को अपनाया जा सकता है। इसके अलावा, डीएनए फाइबर विश्लेषण में मदद करने के लिए छवि विश्लेषण का विवरण प्रदान किया जाता है।
नैनोमटेरियल एक्सपोजर कोशिकाओं में प्रतिकृति तनाव और जीनोमिक अस्थिरता पैदा कर सकता है। अस्थिरता की डिग्री नैनोमटेरियल्स के रसायन विज्ञान, आकार और एकाग्रता, एक्सपोजर के समय और उजागर सेल प्रकार पर निर्भर करती है। कई स्थापित तरीकों का उपयोग यह स्पष्ट करने के लिए किया गया है कि अंतर्जात / बहिर्जात एजेंट वैश्विक प्रतिकृति को कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, डीएनए फाइबर परख जैसे रेप्लिकॉन-स्तरीय परख, यह समझने के लिए अनिवार्य हैं कि ये एजेंट प्रतिकृति दीक्षा, समाप्ति और प्रतिकृति फोर्क प्रगति को कैसे प्रभावित करते हैं। यह जानने से किसी को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति मिलती है कि नैनोमटेरियल्स उत्परिवर्तन निर्धारण और जीनोमिक अस्थिरता की संभावना को कैसे बढ़ाते हैं। हमने ग्राफीन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के तहत प्रतिकृति गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मॉडल कोशिकाओं के रूप में रॉ 264.7 मैक्रोफेज का उपयोग किया। यहां, हम डीएनए फाइबर परख के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें न्यूक्लियोटाइड एनालॉग, सेल लाइसिस के साथ पल्स लेबलिंग, स्लाइड पर पल्स-लेबल डीएनए फाइबर फैलाना, डीएनए फाइबर के भीतर न्यूक्लियोटाइड एनालॉग का फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीएनए फाइबर के भीतर प्रतिकृति मध्यवर्ती की इमेजिंग, और कंप्यूटर-असिस्टेड स्कोरिंग और विश्लेषण (सीएएसए) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिकृति मध्यवर्ती विश्लेषण शामिल है।
प्रत्येक सेल चक्र के दौरान, डीएनए प्रतिकृति सटीक जीनोम दोहरावसुनिश्चित करती है। यूकेरियोटिक क्रोमोसोमल प्रतिकृति अनिवार्य रूप से तीन कारकों पर निर्भर करती है: कई प्रतिकृति उत्पत्ति के फायरिंग का समय, फायर किए गए मूल से निकलने वाले कांटे की गति, और प्रतिकृति प्रक्रिया की समाप्ति जब आसन्न मूल से दो प्रतिकृति कांटेमिलते हैं। बेटी कोशिकाओं को आनुवंशिक जानकारी के उच्च-निष्ठा संचरण के लिए, साथ ही आनुवंशिक अखंडता के संरक्षण के लिए, सटीक डीएनए प्रतिकृति महत्वपूर्ण है। एजेंट जो नियमित चयापचय से विकसित होते हैं या कृत्रिम या प्राकृतिक पर्यावरणीय सामग्री के कारण होते हैं, लगातार जीनोम पर हमला कर रहे हैं। ये अंतर्जात और बहिर्जात एजेंट इन एजेंटों के कारण डीएनए क्षति का सामना करने के कारण प्रतिकृति कांटे को धीमा या बंद कर देते हैं, और इन कठिनाइयों के जवाब में कांटे अस्थायी रूप से धीमा या बंद हो जाते हैं जिसे प्रतिकृति तनाव3 कहा जाता है। प्रतिकृति तनाव के जवाब में, कोशिकाओं ने कई आणविक मार्ग विकसित किए हैं जो परेशान प्रतिकृति फोर्क्स की स्थिरता को बनाए रखते हैं और उन्हें फिरसे शुरू करने की अनुमति देते हैं। आनुवंशिक स्थिरता, कोशिका अस्तित्व और मानव रोग के संदर्भ में, ये प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रिया तंत्र एक स्वस्थ जीनोम को बनाए रखने, सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने और रोग के गठन की संभावना को कमकरने के लिए महत्वपूर्ण कारकों के रूप में उभरे हैं।
प्रतिकृति तनाव पैदा करने में सक्षम बहिर्जात एजेंटों में से एक नैनोकणों है। नैनोपार्टिकल्स ऐसे कण होते हैं जो आकार में 1 एनएम से 100 एनएम6 तक होते हैं। उनके उच्च सतह क्षेत्रों, विशिष्ट आकृतियों और अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण, नैनोकणों का उपयोग विभिन्न चिकित्सा, दवा, पर्यावरण औरऔद्योगिक अनुप्रयोगों में किया जाता है। जबकि नैनोकणों के बहुत सारे संभावित लाभ हैं, उनमें से कुछ (उनकी विरासत में मिली प्रकृति या दीर्घायु के कारण) विषाक्त हो सकते हैं। नैनोपार्टिकल्स चिकित्सा प्रत्यारोपण के प्राकृतिक टूट-फूट के कारण भी बन सकते हैं और पेरी-प्रोस्थेटिक क्षेत्र 9,10 में जारी किए जा सकते हैं।
विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उत्पादित नैनोकणों के असंख्य के लिए मनुष्यों के संपर्क के कारण, नैनोपार्टिकल विषाक्तता के क्षेत्र में अनुसंधान पिछले 10वर्षों में काफी बढ़ गया है। हालांकि इन शोध प्रयासों ने नैनोकणों द्वारा मानव स्वास्थ्य के लिए संभावित खतरे के बारे में बहुतायत में जानकारी का खुलासा किया है, नैनोकणों के जीनोटॉक्सिसिटी पैदा करने की क्षमता के बारे में ज्ञान अभी भी सीमित है। अब तक जो पता चला है वह यह है कि ये नैनोकण शारीरिक रूप से डीएनए के साथ बातचीत कर सकते हैं, डीएनए क्षति को बढ़ावा दे सकते हैं, और डीएनए12 की मरम्मत या प्रतिकृति के लिए जिम्मेदार प्रोटीन को नुकसान पहुंचा सकते हैं या हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह पता लगाने के लिए कि वे डीएनए प्रतिकृति में कैसे हस्तक्षेप करते हैं, डीएनए फाइबर कॉम्बिंग, रेडियोरेसिस्टेंट डीएनए संश्लेषण (आरडीएस), और डीएनए फाइबर विश्लेषण आमतौर पर13,14,15,16 का उपयोग किया जाता है।
डीएनए फाइबर कॉम्बिंग विधि लचीली है और एकल-अणु स्तर17 पर प्रतिकृति फोर्क गतिशीलता के बारे में जानकारी देती है। संक्षेप में, एक सैलिनाइज्ड कवरस्लिप को डीएनए समाधान से धीरे-धीरे वापस ले लिया जाता है जब डीएनए समाप्त हो जाता है। डीएनए अणुओं को समाधान के मेनिस्कस द्वारा सीधा और संरेखित किया जाता है। डीएनए फाइबर की समरूपता, रिक्ति और संरेखण सटीक और भरोसेमंद फाइबर ट्रैक्ट लंबाई माप का समर्थन करते हैं। उपचार की लंबाई और अनुक्रम और तनाव या क्षति का कारण बनने के लिए उपयोग की जाने वाली दवाओं को समायोजित करके, इस एप्लिकेशन का उपयोग करके फोर्क उन्नति के कई पहलुओं की निगरानी की जा सकती है। इस विधि में, एक दोहरी लेबलिंग प्रणाली का उपयोग किया जाता है, जिसके माध्यम से प्रतिकृति कांटे की गति और प्रगति का आकलन17,18 किया जाता है। दूसरी ओर, 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन इस तथ्य का लाभ उठाता है कि, एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन में, ब्रांचिंग डीएनए संरचनाएं एक ही द्रव्यमान के रैखिक डीएनए अणुओं की तुलना में अधिक धीरे-धीरे यात्रा करती हैं, जिससे 2 डी रन में दोनों के स्वच्छ पृथक्करण की अनुमति मिलती है। वास्तव में, इस विधि की जांच डीएनए अणुओं को पहले रन में उनके द्रव्यमान के आधार पर और दूसरे ऑर्थोगोनल रन में उनके आकार के आधार पर अलग करने के लिए की जाती है। जीनोमिक डीएनए विखंडन के बाद, असामान्य प्रतिकृति और पुनर्संयोजन मध्यवर्ती एक शाखा रूप विकसित करते हैं, और उन्हें 2 डी जेल19 में अधिक सामान्य रैखिक अणुओं से अलग किया जा सकता है।
आरडीएस विधि का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि वैश्विक डीएनए संश्लेषण कैसे प्रभावित होता है। इस विधि में, वैश्विक प्रतिकृति के निषेध की डिग्री अनुपचारित बनाम उपचारित कोशिकाओं 14,20 में शामिल रेडियोधर्मी लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स की मात्रा की तुलना करके निर्धारित की जाती है, जैसे कि [14 सी] थाइमिडाइन। अनुपचारित और उपचारित कोशिकाओं के बीच रेडियोलेबलिंग में प्रतिशत अंतर उस डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर डीएनए-हानिकारक एजेंट डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करता है। इसके समान, एक अन्य विधि डीएनए संश्लेषण21,22 की समग्र दरों को मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री के लिए बीआरडीयू (5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन) जैसे न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स को एकीकृत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का उपयोग करती है। हालांकि ये विधियां प्रदर्शित करती हैं कि डीएनए-हानिकारक एजेंट वैश्विक डीएनए संश्लेषण को कैसे प्रभावित करते हैं, वे यह नहीं दिखाते हैं कि व्यक्तिगत रिप्लिकॉन कैसे प्रभावित होते हैं। दरअसल, विषाक्त कण (नैनोमटेरियल) जोखिम की स्थिति में जीनोमिक अस्थिरता की दीक्षा और सीमा को बेहतर ढंग से समझने के लिए रेप्लिकॉन-स्तर के परीक्षण अनिवार्य हैं। डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस23,24,25,26 को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली कुछ विधियां हैं।
असमान रूप से अंतरिक्ष स्रोतों से प्रतिकृति बुलबुले और द्विदिश प्रतिकृति की अवधारणाओं को पहली बार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी27,28 जैसे एकल-अणु परीक्षणों का उपयोग करके विकसित किया गया था। कार्बन-लेपित ग्रिड में फैले विशिष्ट अणुओं पर ब्रांचिंग प्रतिकृति मध्यवर्ती का प्रत्यक्ष अवलोकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बहुत सुविधाजनक है। यह विधि, जो प्रतिकृति कांटे पर पैथोलॉजिकल बदलावों को ट्रैक करने के लिए आज भी उपयोग में है, का उपयोग डीएनए प्रतिकृति28 के पहले यूकेरियोटिक मूल का पता लगाने के लिए किया गया था। फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी नए दोहराए गए क्षेत्रों की ऑटोरेडियोग्राफिक पहचान की अवधारणा और ट्रिटाइज्ड थाइमिडाइन के साथ गुणसूत्रों की पल्स टैगिंग की अवधारणा के आसपास केंद्रित है। मेटाज़ोन जीनोमिक अनुक्रमों में उत्पत्ति घनत्व और प्रतिकृति फोर्क दरों का पहला मात्रात्मक मूल्यांकन डीएनए फाइबर ऑटोरेडियोग्राफी29 द्वारा संभव बनाया गया था।
वर्तमान में, फाइबर फ्लोरोग्राफी विधियों ने ऑटोरेडियोग्राफी की जगह ले ली है, मुख्य रूप से क्योंकि फाइबर फ्लोरोग्राफी ऑटोरेडियोग्राफी की तुलना में बहुत तेज है। फाइबर फ्लोरोग्राफी में, दो हैलोजेनेटेड न्यूक्लियोटाइड डेरिवेटिव, जैसे ब्रोमो- (बीआर), क्लोरो- (सीएल), या आयोडोडोक्सीयूरिडीन (आईडीयू), क्रमिक रूप से ताजा प्रतिकृति डीएनए में शामिल किए जाते हैं और फिर एंटीबॉडी30 का उपयोग करके अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पहचाने जाते हैं। नवजात डीएनए का सूक्ष्म अवलोकन जिसने एक या दोनों एनालॉगों को शामिल किया है, एक रंग में एनालॉगों में से एक और दूसरे एनालॉग को एक अलग रंग में इम्यूनोस्टेनिंग करके संभव बनाया जाता है (उदाहरण के लिए, आईडीयू लाल और शामिल सीएलडीयू हरे रंग के साथ इम्यूनोस्टेनिंग नवजात डीएनए) (चित्रा 1)21)। डीएनए फाइबर विश्लेषण द्वारा कई अलग-अलग प्रकार के प्रतिकृति मध्यवर्ती की पहचान की जा सकती है। सबसे अधिक अध्ययन किए जाने वाले व्यक्तिगत एलॉन्गिंग फोर्क, दीक्षा और समाप्ति हैं। अलग-अलग एलॉन्गिंग फोर्क्स में लाल रंग का प्रतिकृति पैटर्न होता है, जिसके बाद हरा (लाल-हरा; चित्रा 2 ए)। इन मध्यवर्ती की लंबाई का उपयोग अक्सर कांटे की गति (यानी, कांटा लंबाई / पल्स समय) या ट्रैक शॉर्टनिंग (चित्रा 2 ई) 30,31,32 के माध्यम से नवजात डीएनए के एक्सोन्यूक्लियोलाइटिक क्षरण को मापने के लिए किया जाता है। मिमिटौ एट अल द्वारा किए गए एक अध्ययन में, यह पाया गया कि हाइड्रॉक्सीयूरिया के लंबे समय तक संपर्क में रहने पर, एक प्रतिकृति जहर जो डीएनए में डबल-स्ट्रैंड ब्रेक का कारण बनता है, आरई 11 को33 में भर्ती किया गया था। एमआरई 11 एक एक्सोन्यूक्लिज़ है जो अपनी 3′-5′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि के लिए जाना जाता है, और यह मरम्मत के लिए डीएनए के सिरों को काटने में सक्षम है। इसलिए, विषाक्त एजेंटों के संपर्क में आने पर, कोई नवजात डीएनए के एक्सोन्यूक्लियोलाइटिक क्षरण का निरीक्षण कर सकता है, जो डीएनए-हानिकारक एजेंट34 के संपर्क में आने के कारण डीएनए स्ट्रैंड का छोटा होना है।
शारीरिक अवरोधों (डीएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स या डीएनए घावों), रासायनिक बाधाओं, या उत्परिवर्तन द्वारा लाए गए प्रतिकृति कांटा टूटना प्रतिकृति को रोक सकता है और इसे फिर से शुरू करने के लिए समरूप पुनर्संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। इसे बिगड़ा हुआ कांटा प्रगति के रूप में जाना जाता है। कई इन विट्रो और विवो जांचों ने संकेत दिया है कि प्रतिलेखन, कभी-कभी,इस तरह से प्रतिकृति फोर्क प्रगति को रोक सकता है।
दीक्षा प्रतिकृति उत्पत्ति है जो पहली या दूसरी नाड़ी के दौरान शुरू और आग लगाती है। उत्पत्ति जो पहली नाड़ी के दौरान आग लगाती है और प्रतिकृति कांटे होते हैं जो सक्रिय होते रहते हैं, उनमें हरे-लाल-हरे रंग का पैटर्न होता है (चित्रा 2 बी, निचला)। दूसरी पल्स के दौरान शुरू होने वाली उत्पत्ति में एक हरा-केवल पैटर्न होता है (चित्रा 2 बी, ऊपरी) और कभी-कभी इसे नई शुरू की गई उत्पत्ति कहा जाता है, इसलिए उन मूलों को उन लोगों से अलग किया जा सकता है जो पहली नाड़ी के दौरान शुरू होते हैं। दो प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच नए निकाले गए मूल के सापेक्ष प्रतिशत की तुलना किसी को यह समझने की अनुमति देती है कि एक कोशिका डीएनए-हानिकारक एजेंट या प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का जवाब कैसे देती है। समाप्ति तब बनाई जाती है जब आसन्न रिप्लिकॉन से दो प्रतिकृति कांटे विलय हो जाते हैं, और उनके पास लाल-हरे-लाल पैटर्न (चित्रा 2 डी)30 होते हैं।
ऊपर वर्णित तथ्यों के आधार पर, डीएनए फाइबर विश्लेषण को वर्तमान में नैनोमटेरियल्स जैसे विषाक्त एजेंटों के कारण डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता का अध्ययन करने के लिए एक पसंदीदा तरीका माना जाता है। शोधकर्ताओं को अब यूकेरियोट्स में जीनोम-वाइड डीएनए प्रतिकृति की गतिशीलता की अच्छी समझ और ज्ञान है, मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से,इस तकनीक की खोज के कारण। परिणाम चर के आधार पर, कई पद्धतियों को अपनाया जा सकता है। नैनोकणों द्वारा प्रेरित डीएनए क्षति में भिन्नता का अध्ययन करने के तरीकों के कुछ उदाहरण चित्र 3 में दिखाए गए हैं। इस अध्ययन में वर्णित डीएनए फाइबर विश्लेषण विधि का समग्र लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि नैनोकणों ने विट्रो में प्रतिकृति प्रक्रिया को कैसे प्रभावित किया और वे विभिन्न ऊतकों को अलग-अलग कैसे प्रभावित करते हैं।
हम यहां डीएनए फाइबर परख के माध्यम से नैनोकणों की उपस्थिति में डीएनए प्रतिकृति गतिशीलता में भिन्नता के विश्लेषण में सहायता करने के लिए एक विधि पर चर्चा करते हैं। मानक परख में शामिल प्रमुख महत्वपूर्ण क?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक ब्लेज़र फाउंडेशन, बायोमेडिकल साइंसेज में मेडिकल बायोटेक्नोलॉजी प्रोग्राम, यूआईसी रॉकफोर्ड और स्वास्थ्य विज्ञान शिक्षा विभाग, यूआईसी रॉकफोर्ड से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। लेखक ों ने परियोजना में उनके योगदान के लिए अनन्या संगिनेनी और जेम्स ब्रैडली को धन्यवाद दिया।
24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
Rat anti-BrdU | Abcam | BU1–75(ICR1) | |
Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |