Demonstrasjon av DNA-fiberanalysen for å undersøke DNA-skade og reparasjonsdynamikk indusert av nanopartikler

Summary

Metodikken bistår i analysen av variasjon i DNA-replikasjonsdynamikk i nærvær av nanopartikler. Ulike metoder kan vedtas basert på cytotoksisitetsnivået til materialet av interesse. I tillegg er det gitt en beskrivelse av bildeanalysen for å hjelpe til med DNA-fiberanalyse.

Abstract

Eksponering for nanomaterialer kan forårsake replikasjonsstress og genomisk ustabilitet i celler. Graden av ustabilitet avhenger av kjemi, størrelse og konsentrasjon av nanomaterialene, eksponeringstidspunktet og den eksponerte celletypen. Flere etablerte metoder har blitt brukt for å belyse hvordan endogene/eksogene agens påvirker global replikasjon. Imidlertid er analyser på svarnivå, for eksempel DNA-fiberanalysen, avgjørende for å forstå hvordan disse midlene påvirker replikasjonsinitiering, avslutninger og replikasjonsgaffelprogresjon. Å vite dette gjør at man kan forstå bedre hvordan nanomaterialer øker sjansene for mutasjonsfiksering og genomisk ustabilitet. Vi brukte RAW 264.7 makrofager som modellceller for å studere replikasjonsdynamikken under eksponering av grafenoksid nanopartikler. Her demonstrerer vi den grunnleggende protokollen for DNA-fiberanalysen, som inkluderer pulsmerking med nukleotidanaloger, cellelyse, spredning av pulsmerkede DNA-fibre på lysbilder, fluorescerende immunfarging av nukleotidanalogene i DNA-fibrene, avbildning av replikasjonsmellomproduktene i DNA-fibrene ved bruk av konfokalmikroskopi og replikasjonsmellomanalyse ved bruk av en dataassistert scoring og analyse (CASA) programvare.

Introduction

Under hver cellesyklus sikrer DNA-replikasjon nøyaktig genomduplisering¹. Eukaryot kromosomal replikasjon avhenger i hovedsak av tre faktorer: tidspunktet for avfyring av flere replikasjonsopprinnelser, hastigheten på gaflene som kommer fra den avfyrte opprinnelsen, og avslutningen av replikasjonsprosessen når to replikasjonsgafler fra tilstøtende opprinnelse møtes². For high-fidelity overføring av genetisk informasjon til datterceller, samt bevaring av genetisk integritet, er nøyaktig DNA-replikasjon avgjørende. Midler som utvikler seg fra vanlig metabolisme eller skyldes kunstige eller naturlige miljømaterialer, angriper stadig genomet. Disse endogene og eksogene midlene får replikasjonsgaflene til å bremse eller stoppe på grunn av DNA-skade forårsaket av disse midlene, og gaflene som midlertidig bremser eller stopper som svar på disse vanskelighetene, kalles replikasjonsstress³. Som svar på replikasjonsstress har celler utviklet flere molekylære veier som opprettholder stabiliteten til de forstyrrede replikasjonsgaflene og lar dem starte på nytt⁴. Når det gjelder genetisk stabilitet, celleoverlevelse og menneskelig sykdom, har disse replikasjonsstressresponsmekanismene dukket opp som nøkkelfaktorene for å opprettholde et sunt genom, sikre celleoverlevelse og redusere sannsynligheten for sykdomsdannelse⁵.

Et av de eksogene midlene som er i stand til å produsere replikasjonsstress er nanopartikler. Nanopartikler er partikler som varierer i størrelse fra 1 nm til 100 nm⁶. På grunn av deres høye overflatearealer, særegne former og unike kjemiske egenskaper, brukes nanopartikler i ulike medisinske, farmasøytiske, miljømessige og industrielle applikasjoner ^7,8. Mens nanopartikler har mange potensielle fordeler, kan noen av dem (på grunn av deres arvelige natur eller lang levetid) bli giftige. Nanopartikler kan også dannes på grunn av naturlig slitasje på medisinske implantater og slippes ut i det periprotetiske området ^9,10.

På grunn av eksponering av mennesker til et mylder av nanopartikler produsert for ulike applikasjoner, har forskning innen nanopartikkeltoksisitet økt enormt de siste 10 årene¹¹. Selv om disse forskningsinnsatsene har avslørt informasjon i overflod om den potensielle trusselen som nanopartikler utgjør for menneskers helse, er kunnskapen om potensialet for nanopartikler å forårsake gentoksisitet fortsatt begrenset. Det som har blitt oppdaget så langt er at disse nanopartiklene fysisk kan samhandle med DNA, fremme DNA-skade og skade eller forstyrre proteinene som er ansvarlige for å reparere eller replikere DNA¹². For å oppdage hvordan de forstyrrer DNA-replikasjon, brukes vanligvis DNA-fiberkaming, radioresistent DNA-syntese (RDS) og DNA-fiberanalyse^13,14,15,16.

DNA-fiberkammetoden er fleksibel og gir informasjon om replikasjonsgaffeldynamikk på enkeltmolekylnivå¹⁷. I hovedsak trekkes en salinisert coverslip forsiktig ut av DNA-løsningen når DNA-endene binder seg til den. DNA-molekylene rettes ut og justeres av løsningens menisk. Homogeniteten, avstanden og justeringen av DNA-fibrene støtter nøyaktige og pålitelige målinger av fiberkanallengder. Ved å justere lengden og sekvensen av behandlingene og stoffene som brukes til å forårsake stress eller skade, kan mange aspekter av gaffelutvikling overvåkes ved hjelp av dette programmet. I denne metoden brukes et dobbelt merkingssystem, hvorved hastigheten og progresjonen til replikasjonsgaffelen vurderes^17,18. På den annen side utnytter 2D-gelelektroforese det faktum at forgrenings-DNA-strukturer i agarosegelelektroforese beveger seg langsommere enn lineære DNA-molekyler med samme masse, noe som muliggjør ren separasjon av de to i et 2D-løp. Faktisk undersøkes denne metoden for å skille DNA-molekyler basert på deres masse i første kjøring og basert på deres form i den andre ortogonale kjøringen. Etter genomisk DNA-fragmentering utvikler de uvanlige replikasjons- og rekombinasjonsmellomproduktene en forgreningsform, og de kan skilles fra de mer vanlige lineære molekylene i 2D-gelen¹⁹.

RDS-metoden brukes til å bestemme hvordan global DNA-syntese påvirkes. I denne metoden bestemmes graden av inhibering av global replikasjon ved å sammenligne mengden inkorporerte radioaktivt merkede nukleotider, slik som [14C] tymidin, i ubehandlede versus behandlede celler^14,20. Den prosentvise forskjellen i radiomerking mellom de ubehandlede og behandlede cellene representerer i hvilken grad det DNA-skadelige middelet påvirker DNA-syntesen. I likhet med dette bruker en annen metode cellens evne til å integrere nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoksyuridin) for flowcytometri for å måle de totale hastighetene av DNA-syntese^21,22. Selv om disse metodene demonstrerer hvordan DNA-skadelige stoffer påvirker global DNA-syntese, viser de ikke hvordan individuelle svar påvirkes. Faktisk er analyser på replicon-nivå avgjørende for å bedre forstå initiering og omfang av genomisk ustabilitet i tilfelle eksponering for giftige partikler (nanomateriale). DNA-fiberautoradiografi og elektronmikroskopi er noen metoder som brukes til å bestemme denne^23,24,25,26.

Konseptene replikasjonsbobler og toveis replikasjon fra ujevnt fordelte kilder ble først utviklet ved hjelp av enkeltmolekylære tester som elektronmikroskopi og DNA-fiberautoradiografi^27,28. Den direkte observasjonen av forgreningsreplikasjonsmellomprodukter på spesifikke molekyler spredt over et karbonbelagt rutenett blir i stor grad tilrettelagt ved elektronmikroskopi. Denne metoden, som fortsatt er i bruk i dag for å spore patologiske skift ved replikasjonsgafler, ble brukt til å lokalisere den første eukaryote opprinnelsen til DNA-replikasjon²⁸. Fiberautoradiografi er sentrert rundt begrepet autoradiografisk identifikasjon av nylig replikerte områder og pulsmerking av kromosomer med tritiert tymidin. Den første kvantitative evalueringen av opprinnelsestettheter og replikasjonsgaffelhastigheter i metazoan genomiske sekvenser ble muliggjort av DNA-fiberautoradiografi²⁹.

For tiden har fiberfluorografimetoder tatt plass til autoradiografi, hovedsakelig fordi fiberfluorografi er mye raskere enn autoradiografi. I fiberfluorografi blir to halogenerte nukleotidderivater, slik som brom- (Br), klor- (Cl) eller jododeoksyuridin (IdU), sekvensielt inkorporert i ferskt replikert DNA og deretter identifisert ved indirekte immunfluorescens ved bruk av antistoffer³⁰. Mikroskopisk visning av det gryende DNA som har innlemmet en eller begge analogene, er mulig ved å immunfarge en av analogene i en farge og den andre analogen i en annen farge (f.eks. immunostaining nascerende DNA med innlemmet IdU rød og innlemmet CldU grønn) (figur 1) ²¹. Mange forskjellige typer replikasjonsmellomprodukter kan identifiseres ved DNA-fiberanalyse. De mest studerte er individuelle forlengelsesgafler, innvielser og avslutninger. Individuelle forlengelsesgafler har et replikasjonsmønster av rødt etterfulgt av grønt (rødgrønt; Figur 2A). ¹³ Lengdene på disse mellomproduktene brukes ofte til å måle gaffelhastigheten (dvs. gaffellengde/pulstid) eller den eksonukleolytiske nedbrytningen av begynnende DNA gjennom sporforkortelse (figur 2E) ^30,31,32. I en studie av Mimitou et al. ble det funnet at ved langvarig eksponering for hydroksyurea, en replikasjonsgift som forårsaker dobbeltstrengbrudd i DNA, ble RE11 rekruttert³³. MRE11 er en eksonuklease kjent for sin 3′-5′ eksonukleaseaktivitet, og den er i stand til å kutte endene av DNA for reparasjon. Derfor, når man blir utsatt for giftige stoffer, kan man observere eksonukleolytisk nedbrytning av begynnende DNA, som er forkortelsen av DNA-strengen på grunn av eksponering for et DNA-skadelig middel³⁴.

Replikasjonsgaffelbrudd forårsaket av fysiske hindringer (DNA-proteinkomplekser eller DNA-lesjoner), kjemiske hindringer eller mutasjoner kan stoppe replikasjonen og nødvendiggjøre homolog rekombinasjon for å starte den på nytt. Dette er kjent som nedsatt gaffelprogresjon. Tallrike in vitro – og in vivo-undersøkelser har indikert at transkripsjon noen ganger kan forhindre replikasjonsgaffelutvikling på denne måten³⁵.

Initieringer er replikasjonsopprinnelser som starter og skyter under første eller andre puls. Opprinnelser som brenner under første puls og har replikasjonsgafler som fortsetter å være aktive, har et grønn-rød-grønt mønster (figur 2B, nedre). Opprinnelser som starter under den andre pulsen, har et grønt mønster (figur 2B, øvre) og kalles noen ganger nylig initiert opprinnelse, slik at disse opprinnelsene kan differensieres fra de som starter under den første pulsen. Sammenligningen av de relative prosentandelene av nylig avfyrt opprinnelse mellom to eksperimentelle forhold gjør det mulig å forstå hvordan en celle reagerer på et DNA-skadelig middel eller tilstedeværelsen eller fraværet av et protein. Avslutninger opprettes når to replikasjonsgafler fra tilstøtende replikconer slås sammen, og de har et rød-grønn-rødt mønster (figur 2D)³⁰.

Basert på fakta beskrevet ovenfor, er DNA-fiberanalyse for tiden ansett som en foretrukket metode for å studere variasjonen i DNA-replikasjonsdynamikk forårsaket av giftige stoffer som nanomaterialer. Forskere har nå en god forståelse og kunnskap om dynamikken i genom-bred DNA-replikasjon i eukaryoter, både kvantitativt og kvalitativt, på grunn av oppdagelsen av denne teknologien³⁶. Basert på utfallsvariablene kan flere metoder tas i bruk. Noen eksempler på metoder for å studere variasjoner i DNA-skade indusert av eksterne agens/nanopartikler er vist i figur 3. Det overordnede målet med DNA-fiberanalysemetoden beskrevet i denne studien er å bestemme hvordan nanopartikler påvirker replikasjonsprosessen in vitro og hvordan de differensielt påvirker forskjellige vev.

Protocol

1. Fremstilling av antistoffer og buffer Forbered den primære antistoffoppløsningen, mus anti-BrdU ved en 1:300 fortynning i 5% BSA og rotte anti-BrdU ved en 1:500 fortynning i 5% BSA. Klargjør den sekundære antistoffløsningen, alexafluor 594 kaninantimus ved en 1:300 fortynning i 5% BSA og alexafluor 488 kylling anti-rotte ved en 1:500 fortynning i 5% BSA. Forbered den tertiære antistoffløsningen, alexafluor 594 geiteantikanin ved en 1:1,000 fortynning i 5% BSA og al…

Representative Results

Etter å ha fått nok bilder (fra 20-100 bilder per tilstand), må replikasjonsmellomproduktene identifiseres, måles og telles. Enten du analyserer fibrene manuelt eller automatisk via et program38, er det nødvendig å klart definere hvilke egenskaper en fiber må ha for at den skal telles eller scores (eller ikke telles eller måles)39. For eksempel kan følgende spørsmål vurderes. (1) Skal man måle og telle bare fibre med 100% immunfluorescens gjennom fibere…

Discussion

Vi diskuterer her en metode for å bistå i analysen av variasjonen i DNA-replikasjonsdynamikk i nærvær av nanopartikler gjennom DNA-fiberanalysen. Store kritiske trinn involvert i standardanalysen er beskrevet i protokollen (trinn 2.2.2 og trinn 3.1.3). Det anbefales alltid å bruke et område med begrenset overliggende lyseksponering og konstant luftstrøm for å forhindre lysinduserte DNA-brudd i lysbildene, samt for å forbedre reproduserbarheten. Det kreves nøye oppmerksomhet på tidsvarigheten for tørking av ce…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416