Demostración del ensayo de fibra de ADN para investigar el daño del ADN y la dinámica de reparación inducida por nanopartículas

Summary

La metodología ayuda en el análisis de la variación en la dinámica de replicación del ADN en presencia de nanopartículas. Se pueden adoptar diferentes metodologías basadas en el nivel de citotoxicidad del material de interés. Además, se proporciona una descripción del análisis de imágenes para ayudar en el análisis de fibras de ADN.

Abstract

La exposición a nanomateriales puede causar estrés de replicación e inestabilidad genómica en las células. El grado de inestabilidad depende de la química, el tamaño y la concentración de los nanomateriales, el tiempo de exposición y el tipo de célula expuesta. Se han utilizado varios métodos establecidos para dilucidar cómo los agentes endógenos/exógenos afectan la replicación global. Sin embargo, los ensayos a nivel de replicón, como el ensayo de fibra de ADN, son imprescindibles para comprender cómo estos agentes influyen en el inicio de la replicación, las terminaciones y la progresión de la horquilla de replicación. Saber esto permite comprender mejor cómo los nanomateriales aumentan las posibilidades de fijación de mutaciones e inestabilidad genómica. Utilizamos macrófagos RAW 264.7 como células modelo para estudiar la dinámica de replicación bajo la exposición a nanopartículas de óxido de grafeno. Aquí, demostramos el protocolo básico para el ensayo de fibra de ADN, que incluye el marcado de pulsos con análogos de nucleótidos, lisis celular, propagación de las fibras de ADN marcadas con pulsos en portaobjetos, inmunotinción fluorescente de los análogos de nucleótidos dentro de las fibras de ADN, imágenes de los intermediarios de replicación dentro de las fibras de ADN utilizando microscopía confocal y análisis intermedio de replicación utilizando un software de puntuación y análisis asistido por computadora (CASA).

Introduction

Durante cada ciclo celular, la replicación del ADN garantiza una duplicación precisa del genoma¹. La replicación cromosómica eucariota depende esencialmente de tres factores: el momento de la activación de múltiples orígenes de replicación, la velocidad de las bifurcaciones que emergen de los orígenes disparados y la terminación del proceso de replicación cuando dos bifurcaciones de replicación de orígenes adyacentes se encuentran². Para la transmisión de alta fidelidad de información genética a las células hijas, así como para la preservación de la integridad genética, la replicación precisa del ADN es crucial. Los agentes que se desarrollan a partir del metabolismo regular o se deben a materiales ambientales artificiales o naturales atacan constantemente el genoma. Estos agentes endógenos y exógenos hacen que las horquillas de replicación se ralenticen o se detengan debido al daño del ADN causado por estos agentes, y las horquillas que se ralentizan o detienen temporalmente en respuesta a estas dificultades se denominan estrés de replicación³. En respuesta al estrés de replicación, las células han desarrollado varias vías moleculares que mantienen la estabilidad de las horquillas de replicación alteradas y les permiten reiniciar⁴. En términos de estabilidad genética, supervivencia celular y enfermedad humana, estos mecanismos de respuesta al estrés de replicación han surgido como los factores clave para mantener un genoma saludable, asegurar la supervivencia celular y disminuir la probabilidad de formación de enfermedades⁵.

Uno de los agentes exógenos capaces de producir estrés de replicación son las nanopartículas. Las nanopartículas son partículas que varían en tamaño de 1 nm a 100 nm⁶. Debido a sus altas superficies, formas distintivas y propiedades químicas únicas, las nanopartículas se utilizan en diversas aplicaciones médicas, farmacéuticas, ambientales e industriales ^7,8. Si bien las nanopartículas tienen muchos beneficios potenciales, algunas de ellas (debido a su naturaleza heredada o longevidad) pueden volverse tóxicas. Las nanopartículas también pueden formarse debido al desgaste natural de los implantes médicos y liberarse en la región periprotésica ^9,10.

Debido a la exposición de los seres humanos a una miríada de nanopartículas producidas para diversas aplicaciones, la investigación en el campo de la toxicidad de las nanopartículas ha aumentado enormemente en los últimos 10 años¹¹. Si bien estos esfuerzos de investigación han revelado abundante información sobre la amenaza potencial que las nanopartículas representan para la salud humana, el conocimiento sobre el potencial de las nanopartículas para causar genotoxicidad aún es limitado. Lo que se ha descubierto hasta ahora es que estas nanopartículas pueden interactuar físicamente con el ADN, promover el daño del ADN y dañar o interferir con las proteínas responsables de reparar o replicar el ADN¹². Para detectar cómo interfieren con la replicación del ADN, el peinado de fibras de ADN, la síntesis de ADN radiorresistente (RDS) y el análisis de fibras de ADN se utilizan típicamente^13,14,15,16.

El método de peinado de fibras de ADN es flexible y proporciona información sobre la dinámica de la horquilla de replicación en el nivel¹⁷ de una sola molécula. En esencia, un cubreobjetos salinizado se retira suavemente de la solución de ADN una vez que los extremos de ADN se unen a ella. Las moléculas de ADN son enderezadas y alineadas por el menisco de la solución. La homogeneidad, el espaciado y la alineación de las fibras de ADN respaldan mediciones precisas y confiables de la longitud del tracto de fibra. Al ajustar la duración y la secuencia de los tratamientos y los medicamentos utilizados para causar estrés o daño, muchos aspectos del avance de la horquilla se pueden monitorear utilizando esta aplicación. En este método, se utiliza un sistema de etiquetado dual, a través del cual se evalúa la velocidad y la progresión de la horquilla de replicación^17,18. Por otro lado, la electroforesis en gel 2D aprovecha el hecho de que, en la electroforesis en gel de agarosa, las estructuras de ADN ramificadas viajan más lentamente que las moléculas de ADN lineales de la misma masa, lo que permite la separación limpia de las dos en una ejecución 2D. De hecho, este método se investiga para segregar moléculas de ADN en función de su masa en la primera ejecución y en función de su forma en la segunda ejecución ortogonal. Después de la fragmentación del ADN genómico, los intermediarios de replicación y recombinación poco comunes desarrollan una forma de ramificación, y pueden distinguirse de las moléculas lineales más comunes en el gel^{2D 19}.

El método RDS se utiliza para determinar cómo se ve afectada la síntesis global de ADN. En este método, el grado de inhibición de la replicación global se determina comparando la cantidad de nucleótidos marcados radiactivamente incorporados, como la timidina [14C], en células no tratadas versus células tratadas^14,20. La diferencia porcentual en el radiomarcado entre las células no tratadas y tratadas representa el grado en que el agente dañino para el ADN afecta la síntesis de ADN. Similar a esto, otro método utiliza la capacidad de las células para integrar análogos de nucleótidos como BrdU (5-bromo-2′-desoxiuridina) para la citometría de flujo para medir las tasas generales de síntesis de ADN^21,22. Si bien estos métodos demuestran cómo los agentes que dañan el ADN afectan la síntesis global de ADN, no muestran cómo se ven afectados los replicones individuales. De hecho, los ensayos a nivel de replicón son imprescindibles para comprender mejor el inicio y el alcance de la inestabilidad genómica en caso de exposición a partículas tóxicas (nanomateriales). La autorradiografía de fibra de ADN y la microscopía electrónica son algunos métodos utilizados para determinar esto^23,24,25,26.

Los conceptos de burbujas de replicación y replicación bidireccional de fuentes espaciadas de manera desigual se desarrollaron por primera vez utilizando pruebas de moléculas individuales como microscopía electrónica y autorradiografía de fibra de ADN^27,28. La observación directa de intermediarios de replicación ramificados en moléculas específicas dispersas a través de una rejilla recubierta de carbono se ve facilitada en gran medida por la microscopía electrónica. Este método, que todavía está en uso hoy en día para rastrear cambios patológicos en las horquillas de replicación, fue utilizado para localizar el primer origen eucariota de la replicación del ADN²⁸. La autorradiografía de fibra se centra en el concepto de la identificación autorradiográfica de áreas recién replicadas y el marcado de pulso de cromosomas con timidina tritiada. La primera evaluación cuantitativa de densidades de origen y tasas de horquilla de replicación en secuencias genómicas de metazoos fue posible por autorradiografía de fibra de ADN²⁹.

Actualmente, los métodos de fluorografía de fibra han tomado el lugar de la autorradiografía, principalmente porque la fluorografía de fibra es mucho más rápida que la autorradiografía. En la fluorografía de fibras, dos derivados nucleótidos halogenados, como el bromo- (Br), cloro- (Cl) o yododesoxiuridina (IdU), se incorporan secuencialmente en el ADN recién replicado y luego se identifican por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos³⁰. La visualización microscópica del ADN naciente que ha incorporado uno o ambos análogos es posible mediante la inmunotinción de uno de los análogos en un color y el otro análogo en un color diferente (por ejemplo, inmunotinción del ADN naciente con IdU incorporado rojo y CldU incorporado verde) (Figura 1)²¹. Se pueden identificar muchos tipos diferentes de intermediarios de replicación mediante el análisis de fibras de ADN. Los más comúnmente estudiados son las horquillas de alargamiento individuales, las iniciaciones y las terminaciones. Las horquillas alargadas individuales tienen un patrón de replicación de rojo seguido de verde (rojo-verde; Figura 2A). ¹³ Las longitudes de estos intermedios se utilizan con frecuencia para medir la velocidad de la horquilla (es decir, la longitud de la horquilla/tiempo de pulso) o la degradación exonucleolítica del ADN naciente a través del acortamiento de la pista (Figura 2E)^30,31,32. En un estudio de Mimitou et al., se encontró que tras la exposición a largo plazo a la hidroxiurea, un veneno de replicación que causa roturas de doble cadena en el ADN, RE11 fue reclutado³³. MRE11 es una exonucleasa conocida por su actividad exonucleasa 3′-5′, y es capaz de cortar los extremos del ADN para su reparación. Por lo tanto, cuando se expone a agentes tóxicos, se puede observar degradación exonucleolítica del ADN naciente, que es el acortamiento de la cadena de ADN debido a la exposición a un agente dañino para el ADN³⁴.

Las roturas de la horquilla de replicación provocadas por obstrucciones físicas (complejos ADN-proteína o lesiones de ADN), impedimentos químicos o mutaciones pueden detener la replicación y requerir una recombinación homóloga para reiniciarla. Esto se conoce como progresión deteriorada de la horquilla. Numerosas investigaciones in vitro e in vivo han indicado que la transcripción puede, en ocasiones, impedir el avance de la horquilla de replicación de esta manera³⁵.

Las iniciaciones son orígenes de replicación que se inician y disparan durante el primer o segundo pulso. Los orígenes que se activan durante el primer pulso y tienen horquillas de replicación que continúan activas tienen un patrón verde-rojo-verde (Figura 2B, inferior). Los orígenes que se inician durante el segundo pulso tienen un patrón de solo verde (Figura 2B, superior) y a veces se denominan orígenes recién iniciados, por lo que esos orígenes se pueden diferenciar de los que se inician durante el primer pulso. La comparación de los porcentajes relativos de orígenes recién disparados entre dos condiciones experimentales permite comprender cómo responde una célula a un agente dañino para el ADN o a la presencia o ausencia de una proteína. Las terminaciones se crean cuando dos bifurcaciones de replicación de replicones adyacentes se fusionan y tienen un patrón rojo-verde-rojo (Figura 2D)³⁰.

Con base en los hechos descritos anteriormente, el análisis de fibras de ADN se considera actualmente un método preferido para estudiar la variación en la dinámica de replicación del ADN causada por agentes tóxicos como los nanomateriales. Los investigadores ahora tienen una buena comprensión y conocimiento de la dinámica de la replicación del ADN de todo el genoma en eucariotas, tanto cuantitativa como cualitativamente, debido al descubrimiento de esta tecnología³⁶. Sobre la base de las variables de resultado, se pueden adoptar varias metodologías. Algunos ejemplos de métodos para estudiar las variaciones en el daño del ADN inducido por agentes externos / nanopartículas se muestran en la Figura 3. El objetivo general del método de análisis de fibras de ADN descrito en este estudio es determinar cómo las nanopartículas afectan el proceso de replicación in vitro y cómo afectan diferencialmente a varios tejidos.

Protocol

1. Preparación de anticuerpos y tampón Preparar la solución primaria de anticuerpos, anti-BrdU de ratón en una dilución 1:300 en BSA al 5% y anti-BrdU de rata en una dilución 1:500 en BSA al 5%. Prepare la solución secundaria de anticuerpos, alexafluor 594 rabbit anti-mouse en una dilución 1:300 en 5% BSA y alexafluor 488 pollo anti-rata en una dilución 1:500 en 5% BSA. Prepare la solución de anticuerpos terciarios, alexafluor 594 cabra anti-conejo en una dilución…

Representative Results

Después de obtener suficientes imágenes (de 20 a 100 imágenes por condición), los intermediarios de replicación deben identificarse, medirse y contarse. Ya sea analizando las fibras manual o automáticamente a través de un programa38, es necesario definir claramente qué características debe tener una fibra para que pueda ser contada o puntuada (o no contada o medida)39. Por ejemplo, se pueden considerar las siguientes preguntas. (1) ¿Se deben medir y conta…

Discussion

Discutimos aquí un método para ayudar en el análisis de la variación en la dinámica de replicación del ADN en presencia de nanopartículas a través del ensayo de fibra de ADN. Los principales pasos críticos implicados en el ensayo patrón se describen en el protocolo (paso 2.2.2 y paso 3.1.3). Siempre se recomienda utilizar un área con exposición limitada a la luz aérea y flujo de aire constante para evitar roturas de ADN inducidas por la luz en los portaobjetos, así como para mejorar la reproducibilidad. Se …

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416