Demonstration av DNA-fiberanalysen för att undersöka DNA-skador och reparationsdynamik inducerad av nanopartiklar

Summary

Metodiken hjälper till vid analys av variation i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar. Olika metoder kan antas baserat på cytotoxicitetsnivån för materialet av intresse. Dessutom tillhandahålls en beskrivning av bildanalysen för att hjälpa till vid DNA-fiberanalys.

Abstract

Exponering för nanomaterial kan orsaka replikationsstress och genomisk instabilitet i celler. Graden av instabilitet beror på nanomaterialens kemi, storlek och koncentration, exponeringstiden och den exponerade celltypen. Flera etablerade metoder har använts för att belysa hur endogena/exogena medel påverkar global replikering. Analyser på svarsnivå, såsom DNA-fiberanalysen, är dock absolut nödvändiga för att förstå hur dessa medel påverkar replikationsinitiering, avslutningar och replikationsgaffelprogression. Att veta detta gör att man bättre kan förstå hur nanomaterial ökar risken för mutationsfixering och genomisk instabilitet. Vi använde RAW 264.7 makrofager som modellceller för att studera replikationsdynamiken under exponering för grafenoxidnanopartiklar. Här demonstrerar vi det grundläggande protokollet för DNA-fiberanalysen, som inkluderar pulsmärkning med nukleotidanaloger, celllys, spridning av de pulsmärkta DNA-fibrerna på objektglas, fluorescerande immunfärgning av nukleotidanalogerna i DNA-fibrerna, avbildning av replikationsintermediärerna inom DNA-fibrerna med hjälp av konfokalmikroskopi och replikationsintermediär analys med hjälp av en datorstödd poäng- och analysprogramvara (CASA).

Introduction

Under varje cellcykel säkerställer DNA-replikation noggrann genomduplicering¹. Eukaryot kromosomal replikation beror i huvudsak på tre faktorer: tidpunkten för avfyrningen av flera replikeringsursprung, hastigheten på gafflarna som kommer från de utlösta ursprungen och avslutningen av replikeringsprocessen när två replikeringsgafflar från intilliggande ursprung möts². För högkvalitativ överföring av genetisk information till dotterceller, liksom bevarande av genetisk integritet, är korrekt DNA-replikation avgörande. Medel som utvecklas från regelbunden metabolism eller beror på konstgjorda eller naturliga miljömaterial attackerar ständigt genomet. Dessa endogena och exogena medel orsakar replikationsgafflar att sakta ner eller stoppa på grund av att de stöter på DNA-skador orsakade av dessa medel, och gafflarna som tillfälligt saktar ner eller stannar som svar på dessa svårigheter kallas replikationsstress³. Som svar på replikationsstress har celler utvecklat flera molekylära vägar som upprätthåller stabiliteten hos de störda replikationsgafflarna och tillåter dem att starta om⁴. När det gäller genetisk stabilitet, cellöverlevnad och mänsklig sjukdom har dessa replikationsstressresponsmekanismer framträtt som nyckelfaktorerna för att upprätthålla ett hälsosamt genom, säkerställa cellöverlevnad och minska sannolikheten för sjukdomsbildning⁵.

Ett av de exogena medel som kan producera replikationsstress är nanopartiklar. Nanopartiklar är partiklar som varierar i storlek från 1 nm till 100 nm⁶. På grund av deras höga ytor, distinkta former och unika kemiska egenskaper används nanopartiklar i olika medicinska, farmaceutiska, miljömässiga och industriella applikationer ^7,8. Medan nanopartiklar har många potentiella fördelar kan vissa av dem (på grund av deras ärftliga natur eller livslängd) bli giftiga. Nanopartiklar kan också bildas på grund av det naturliga slitaget på medicinska implantat och släppas ut i periprotesregionen ^9,10.

På grund av människors exponering för en myriad av nanopartiklar som produceras för olika tillämpningar har forskningen inom nanopartikeltoxicitet ökat enormt under de senaste 10 åren¹¹. Även om dessa forskningsinsatser har avslöjat information i överflöd om det potentiella hot som nanopartiklar utgör för människors hälsa, är kunskapen om potentialen för nanopartiklar att orsaka genotoxicitet fortfarande begränsad. Vad som hittills har upptäckts är att dessa nanopartiklar fysiskt kan interagera med DNA, främja DNA-skador och skada eller störa proteinerna som är ansvariga för att reparera eller replikera DNA¹². För att upptäcka hur de stör DNA-replikation används vanligtvis DNA-fiberkamning, radioresistent DNA-syntes (RDS) och DNA-fiberanalys^13,14,15,16.

DNA-fiberkamningsmetoden är flexibel och ger information om replikationsgaffeldynamik på enmolekylnivå¹⁷. I huvudsak dras ett saliniserat täckglas försiktigt från DNA-lösningen när DNA-ändarna binder till den. DNA-molekylerna rätas ut och justeras av lösningens menisk. DNA-fibrernas homogenitet, avstånd och inriktning stöder noggranna och pålitliga mätningar av fiberkanallängden. Genom att justera längden och sekvensen av behandlingarna och de läkemedel som används för att orsaka stress eller skada kan många aspekter av gaffelframsteg övervakas med hjälp av denna applikation. I denna metod används ett dubbelt märkningssystem, genom vilket replikeringsgaffelns hastighet och progression bedöms^17,18. Å andra sidan utnyttjar 2D-gelelektrofores det faktum att i agarosgelelektrofores färdas förgrenande DNA-strukturer långsammare än linjära DNA-molekyler av samma massa, vilket möjliggör en ren separation av de två i en 2D-körning. Faktum är att denna metod undersöks för att segregera DNA-molekyler baserat på deras massa i den första körningen och baserat på deras form i den andra ortogonala körningen. Efter genomisk DNA-fragmentering utvecklar de ovanliga replikations- och rekombinationsintermediärerna en förgreningsform, och de kan särskiljas från de vanligare linjära molekylerna i 2D-gel¹⁹.

RDS-metoden används för att bestämma hur global DNA-syntes påverkas. I denna metod bestäms graden av hämning av global replikation genom att jämföra mängden inkorporerade radioaktivt märkta nukleotider, såsom [14C] tymidin, i obehandlade kontra behandlade celler^14,20. Den procentuella skillnaden i radiomärkning mellan de obehandlade och behandlade cellerna representerar i vilken grad det DNA-skadliga medlet påverkar DNA-syntesen. I likhet med detta använder en annan metod cellernas förmåga att integrera nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoxiuridin) för flödescytometri för att mäta de totala hastigheterna för DNA-syntes^21,22. Medan dessa metoder visar hur DNA-skadliga medel påverkar global DNA-syntes, visar de inte hur enskilda replicons påverkas. Analyser på svarsnivå är absolut nödvändiga för att bättre förstå initieringen och omfattningen av genomisk instabilitet i händelse av exponering för toxiska partiklar (nanomaterial). DNA-fiberautoradiografi och elektronmikroskopi är några metoder som används för att bestämma detta^23,24,25,26.

Begreppen replikationsbubblor och dubbelriktad replikation från ojämnt fördelade källor utvecklades först med hjälp av enmolekylära tester som elektronmikroskopi och DNA-fiberautoradiografi^27,28. Den direkta observationen av förgreningsreplikationsintermediärer på specifika molekyler dispergerade över ett kolbelagt rutnät underlättas avsevärt av elektronmikroskopi. Denna metod, som fortfarande används idag för att spåra patologiska skift vid replikationsgafflar, användes för att lokalisera det första eukaryota ursprunget till DNA-replikation²⁸. Fiber autoradiografi är centrerad kring begreppet autoradiografisk identifiering av nyligen replikerade områden och pulsmärkning av kromosomer med tritierad tymidin. Den första kvantitativa utvärderingen av ursprungstätheter och replikationsgaffelhastigheter i metazoa genomiska sekvenser möjliggjordes av DNA-fiberautoradiografi²⁹.

För närvarande har fiberfluorografimetoder tagit plats för autoradiografi, främst för att fiberfluorografi är mycket snabbare än autoradiografi. I fiberfluorografi införlivas två halogenerade nukleotidderivat, såsom brom- (Br), klor- (Cl) eller joddeoxiuridin (IdU), sekventiellt i nyligen replikerat DNA och identifieras sedan genom indirekt immunofluorescens med användning av antikroppar³⁰. Mikroskopisk visning av det framväxande DNA som har införlivat en eller båda analogerna möjliggörs genom immunfärgning av en av analogerna i en färg och den andra analogen i en annan färg (t.ex. immunfärgning av begynnande DNA med inkorporerat IdU-rött och inkorporerat CldU-grönt) (figur 1)²¹. Många olika typer av replikationsintermediärer kan identifieras genom DNA-fiberanalys. De vanligast studerade är enskilda töjningsgafflar, initieringar och avslutningar. Enskilda töjbara gafflar har ett replikeringsmönster av rött följt av grönt (rödgrönt; Figur 2A). ¹³ Längden på dessa intermediärer används ofta för att mäta gaffelhastigheten (dvs. gaffellängd/pulstid) eller den exonukleolytiska nedbrytningen av begynnande DNA genom spårförkortning (figur 2E)^30,31,32. I en studie av Mimitou et al. fann man att vid långvarig exponering för hydroxiurea, ett replikationsgift som orsakar dubbelsträngsbrott i DNA, rekryterades RE11³³. MRE11 är ett exonukleas som är känt för sin 3′-5′ exonukleasaktivitet, och det kan skära ändarna av DNA för reparation. Därför kan man, när man utsätts för giftiga ämnen, observera exonukleolytisk nedbrytning av begynnande DNA, vilket är förkortningen av DNA-strängen på grund av exponering för ett DNA-skadligt medel³⁴.

Replikationsgaffelbrott orsakade av fysiska hinder (DNA-proteinkomplex eller DNA-lesioner), kemiska hinder eller mutationer kan stoppa replikationen och kräva homolog rekombination för att starta om den. Detta kallas nedsatt gaffelprogression. Många in vitro- och in vivo-undersökningar har indikerat att transkription ibland kan förhindra framsteg med replikationsgaffel på detta sätt³⁵.

Initieringar är replikationsursprung som initierar och utlöses under den första eller andra pulsen. Ursprung som avfyras under den första pulsen och har replikationsgafflar som fortsätter att vara aktiva har ett grön-röd-grönt mönster (figur 2B, lägre). Ursprung som initieras under den andra pulsen har ett grönt mönster (figur 2B, övre) och kallas ibland nyinitierat ursprung, så dessa ursprung kan särskiljas från de som initieras under den första pulsen. Jämförelsen av de relativa procentandelarna av nyligen avfyrade ursprung mellan två experimentella förhållanden gör att man kan förstå hur en cell svarar på ett DNA-skadligt medel eller närvaron eller frånvaron av ett protein. Avslutningar skapas när två replikeringsgafflar från intilliggande replicons sammanfogas och de har ett röd-grön-rött mönster (figur 2D)³⁰.

Baserat på de fakta som beskrivs ovan anses DNA-fiberanalys för närvarande vara en föredragen metod för att studera variationen i DNA-replikationsdynamik orsakad av giftiga ämnen såsom nanomaterial. Forskare har nu en god förståelse och kunskap om dynamiken i genomomfattande DNA-replikation i eukaryoter, både kvantitativt och kvalitativt, på grund av upptäckten av denna teknik³⁶. Baserat på utfallsvariablerna kan flera metoder användas. Några exempel på metoder för att studera variationer i DNA-skador inducerade av externa agenter/nanopartiklar visas i figur 3. Det övergripande målet med DNA-fiberanalysmetoden som beskrivs i denna studie är att bestämma hur nanopartiklar påverkar replikationsprocessen in vitro och hur de påverkar olika vävnader differentiellt.

Protocol

1. Beredning av antikroppar och buffert Bered den primära antikroppslösningen, mus-anti-BrdU i en spädning på 1:300 i 5 % BSA och anti-BrdU på råtta i en spädning på 1:500 i 5 % BSA. Bered den sekundära antikroppslösningen, alexafluor 594 kaninantimus vid en spädning på 1:300 i 5% BSA och alexafluor 488 kycklingantiråtta vid en spädning på 1:500 i 5% BSA. Bered den tertiära antikroppslösningen, alexafluor 594 getantikanin i en spädning på 1:1 000 i 5 % BSA…

Representative Results

När du har fått tillräckligt med bilder (från 20–100 bilder per villkor) måste replikeringsintermediärerna identifieras, mätas och räknas. Oavsett om fibrerna analyseras manuellt eller automatiskt via ett program38, är det nödvändigt att tydligt definiera vilka egenskaper en fiber måste ha för att den ska räknas eller poängsättas (eller inte räknas eller mätas)39. Till exempel kan följande frågor övervägas. (1) Ska man mäta och räkna endas…

Discussion

Vi diskuterar här en metod för att hjälpa till med analysen av variationen i DNA-replikationsdynamik i närvaro av nanopartiklar genom DNA-fiberanalysen. Viktiga kritiska steg som ingår i standardtestet beskrivs i protokollet (steg 2.2.2 och steg 3.1.3). Det rekommenderas alltid att använda ett område med begränsad exponering för takljus och konstant luftflöde för att förhindra ljusinducerade DNA-brott i objektglasen samt för att förbättra reproducerbarheten. Noggrann uppmärksamhet krävs på tidslängden …

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416