Analyse av ekstracellulær vesikkelmediert vaskulær forkalkning ved bruk av in vitro og in vivo modeller

Summary

Denne artikkelen presenterer metodikken for å oppnå og vurdere vaskulær forkalkning ved å isolere murine aorta etterfulgt av ekstraksjon av forkalkede ekstracellulære vesikler for å observere mineraliseringspotensialet.

Abstract

Kardiovaskulær sykdom er den ledende dødsårsaken i verden, og vaskulær forkalkning er den viktigste prediktoren for kardiovaskulære hendelser; Imidlertid er det for tiden ingen behandling eller terapeutiske alternativer for vaskulær forkalkning. Forkalkning begynner i spesialiserte ekstracellulære vesikler (EV), som tjener som nukleerende foci ved å aggregere kalsium- og fosfationer. Denne protokollen beskriver metoder for å oppnå og vurdere forkalkning i murine aorta og analysere tilhørende ekstraherte EVer. Først utføres grov disseksjon av musen for å samle eventuelle relevante organer, for eksempel nyrer, lever og lunger. Deretter isoleres murine aorta og skjæres ut fra aortaroten til lårarterien. To til tre aortaer blir deretter samlet og inkubert i en fordøyelsesløsning før de gjennomgår ultrasentrifugering for å isolere elbilene av interesse. Deretter bestemmes mineraliseringspotensialet til elbilene gjennom inkubering i en høyfosfatløsning og måling av lysabsorbansen ved en bølgelengde på 340 nm. Til slutt brukes kollagenhydrogeler til å observere den forkalkede mineraldannelsen og modningen produsert av elbilene in vitro.

Introduction

Forkalkning er den viktigste prediktoren for hjerte- og karsykdom, dødelighet og sykelighet¹. Forkalkning endrer arterieveggmekanikken på grunn av opphopning av kalsium- og fosfatmineraler². Ved aterosklerose kan forkalkning forverre lokalt stress og resultere i plakkbrudd, som er den viktigste årsaken til hjerteinfarkt. Medial forkalkning – ofte som følge av kronisk nyresykdom – er mer utbredt og fører til betydelig arteriell avstivning, dysfunksjon og hjerteoverbelastning ^2,3. For tiden er det ingen terapeutiske alternativer for behandling eller forebygging av vaskulær forkalkning.

Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) vedtar en osteoblastlignende fenotype og frigjør forkalkende ekstracellulære vesikler (EV) som kjerner begynnende mineraler, og driver dermed forkalkning ^4,5,6. Denne prosessen ligner den fysiologiske mineraliseringen av osteoblaster i bein⁷. Selv om endepunktet for mineralisering er lik i vaskulærveggen og beinmatrisen, er mekanismene som de forkalkende EVene kommer fra, forskjellig i de to vevene⁸. Det finnes mange typer modeller som brukes til å studere vaskulær forkalkning. In vitro etterligner cellekulturmodeller den osteogene overgangen til VSMC og påfølgende mineraldannelse med spesialiserte medier.

Når man studerer in vivo forkalkning, avhenger modellen som brukes av hvilken type forkalkning som studeres. Hyperlipidemiske musemodeller brukes ofte til å studere aterosklerotisk forkalkning, som virker mer fokusert i lipidrike plakk⁹. I motsetning til dette er medial forkalkning mer utbredt gjennom vaskulaturen og studeres ofte ved hjelp av kroniske nyresykdomsmodeller som benytter et adeninrikt diettregime for å indusere nyresvikt eller kirurgiske teknikker for å fjerne betydelige deler av nyrene^10,11. Aggressive modeller av vaskulær forkalkning har brukt en kombinasjon av både hyperlipidemiske og kroniske nyresykdomsmodeller¹². Denne protokollen gir en metode for å vurdere vaskulær forkalkning i murine aorta for både mediale og aterosklerotiske forkalkninger, ekstrahere EV fra aortaveggen og observere mineraliseringspotensialet i EVene hentet fra in vitro cellekulturmodeller. Fremtidige studier kan bruke disse prosedyrene i mekanistiske analyser av vaskulær forkalkning og for å vurdere potensielle terapeutiske inngrep.

Protocol

In vivo-arbeidet ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Florida International University og i samsvar med gjeldende retningslinjer for National Institutes of Health (NIH). For denne protokollen varierer prosedyren ikke avhengig av musens belastning, vekt, alder og kjønn. Den type forkalkning som studeres, dietter og behandlinger kan endre lengden på studien og vekten av musen som brukes, og kan være avhengig av en bestemt stamme og kjønn av mus som brukes i stud…

Representative Results

Når aortaene er ekstrahert, viser avbildning med nær-infrarød optisk skanner en visuell fremstilling av aorta så vel som vaskulær forkalkning (figur 1). Pikselintensitetsverdiene i det skannede fluorescerende bildet representerer fordelingen av forkalkning og vises her ved hjelp av et farget varmekart. Kvantifiseringsmetoder inkluderer å identifisere en positiv terskel og rapportere prosentvis areal av aorta med verdier større enn denne terskelverdien og / eller rapportere gjennomsnit…

Discussion

Når du utfører protokollen, er det viktig å merke seg de kritiske trinnene for å oppnå vellykkede resultater. Under isolering av murine aorta er det viktig at perfusjonen utføres riktig. Ved injeksjon av PBS må det utvises forsiktighet for ikke å punktere høyre ventrikkel. Dette vil føre til at væsken lekker direkte ut av ventrikkelen og ikke klarer å sirkulere gjennom lungene, og etterlater blod i aorta. Når perfusjonen er utført riktig og mikrodisseksjon har begynt, må alt fett- og fettvev fjernes fra ao…

Materials

8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153