In Vitro 및 In Vivo 모델을 사용한 세포외 Vesicle-Mediated Vascular Calcification 분석
Summary
이 논문은 광물화 가능성을 관찰하기 위해 쥐 대동맥을 분리한 후 석회화된 세포외 소포를 추출하여 혈관 석회화를 얻고 평가하는 방법론을 제시합니다.
Abstract
심혈관 질환은 세계의 주요 사망 원인이며 혈관 석회화는 심혈관 사건의 가장 중요한 예측 인자입니다. 그러나 현재 혈관 석회화에 대한 치료 또는 치료 옵션은 없습니다. 석회화는 칼슘과 인산 이온을 응집시켜 핵 초점 역할을 하는 특수 세포외 소포(EV) 내에서 시작됩니다. 이 프로토콜은 쥐 대동맥에서 석회화를 획득 및 평가하고 관련 추출된 EV를 분석하는 방법을 설명합니다. 먼저, 마우스의 육안 절개를 수행하여 신장, 간 및 폐와 같은 관련 장기를 수집합니다. 그런 다음 쥐 대동맥을 분리하여 대동맥 뿌리에서 대퇴 동맥으로 절제합니다. 그런 다음 2-3개의 대동맥을 모아 소화액에서 배양한 후 초원심분리를 거쳐 관심 있는 EV를 분리합니다. 다음으로, 고인산염 용액에서 배양하고 파장 340nm에서 광흡광도를 측정하여 EV의 광물화 전위를 측정합니다. 마지막으로, 콜라겐 하이드로겔은 시험관 내에서 EV에 의해 생성된 석회화된 미네랄 형성 및 성숙을 관찰하는 데 사용됩니다.
Introduction
석회화는 심혈관 질환 사망률 및 이환율의 가장 중요한 예측 인자이다1. 석회화는 칼슘과 인산염 미네랄의 축적으로 인해 동맥벽 역학을 변화시킵니다2. 죽상동맥경화증에서 석회화는 국소 스트레스를 악화시키고 심장마비의 주요 원인인 플라크 파열을 유발할 수 있습니다. 종종 만성 신장 질환으로 인한 내측 석회화는 더 널리 퍼져 있으며 심각한 동맥 경화, 기능 장애 및 심장 과부하를 유발합니다 2,3. 현재 혈관 석회화의 치료 또는 예방을 위한 치료 옵션은 없습니다.
혈관 평활근 세포(VSMC)는 조골세포와 유사한 표현형을 채택하고 초기 미네랄을 핵화하는 석회화 세포외 소포(EV)를 방출하여 석회화를 유발합니다 4,5,6. 이 과정은 뼈7에서 조골 세포의 생리적 광물 화와 유사합니다. 광물화의 종점은 혈관벽과 뼈 기질에서 유사하지만, 석회화 EV가 발생하는 메커니즘은 두 조직에서 다르다8. 혈관 석회화를 연구하는 데 사용되는 많은 유형의 모델이 있습니다. 시험관 내에서 세포 배양 모델은 VSMC의 골형성 전이 및 특수 배지를 사용한 후속 미네랄 형성을 모방합니다.
생체 내 석회화를 연구할 때 사용되는 모델은 연구 중인 석회화 유형에 따라 다릅니다. 고지혈증 마우스 모델은 죽상경화성 석회화를 연구하는 데 자주 사용되며, 이는 지질이 풍부한 플라크에서 더 집중적으로 나타난다9. 대조적으로, 내측 석회화는 맥관 구조 전체에 더 널리 퍼져 있으며, 종종 신부전을 유도하기 위해 아데닌이 풍부한 식이 요법을 사용하거나 신장의 상당 부분을 제거하기 위한 수술 기술을 사용하는 만성 신장 질환 모델을 사용하여 연구된다10,11. 공격적인 혈관 석회화 모델은 고지혈증과 만성 신장 질환 모델을 모두 조합하여 사용했다12. 이 프로토콜은 내측 및 죽상동맥경화성 석회화 모두에 대해 쥐 대동맥에서 혈관 석회화를 평가하고, 대동맥 벽에서 EV를 추출하고, 시험관 내 세포 배양 모델에서 얻은 EV의 광물화 가능성을 관찰하는 방법을 제공합니다. 향후 연구에서는 혈관 석회화의 기계론적 분석과 잠재적인 치료 개입을 평가하기 위해 이러한 절차를 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜을 수행할 때 성공적인 결과를 얻기 위한 중요한 단계를 기록하는 것이 중요합니다. 쥐 대동맥을 분리하는 동안 관류가 제대로 수행되는 것이 중요합니다. PBS를 주사 할 때 우심실에 구멍이 뚫리지 않도록주의해야합니다. 이렇게 하면 액체가 심실에서 직접 누출되어 폐를 순환하지 못하여 대동맥 내에 혈액이 남게 됩니다. 관류가 제대로 수행되고 미세 해부가 시작되면 완료 및 스캔 전?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (NIH)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (1R01HL160740 및 5 T32GM132054-04)와 플로리다 심장 연구 재단의 보조금으로 지원되었습니다. 하이드로겔을 합성하고 이미징하는 데 도움을 준 Kassandra Gomez에게 감사드립니다.
Materials
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
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