Анализ внеклеточной везикуло-опосредованной кальцификации сосудов с использованием моделей in vitro и in vivo
Summary
В данной работе представлена методика получения и оценки кальцификации сосудов путем выделения мышиных аорт с последующим извлечением кальцинированных внеклеточных везикул для наблюдения за потенциалом минерализации.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти в мире, а кальцификация сосудов является наиболее значимым предиктором сердечно-сосудистых событий; Тем не менее, в настоящее время нет лечения или терапевтических вариантов кальцификации сосудов. Кальцификация начинается в специализированных внеклеточных везикулах (ВВ), которые служат очагами зарождения путем агрегации ионов кальция и фосфата. В этом протоколе описываются методы получения и оценки кальцификации в мышиных аортах и анализа связанных с ними извлеченных ВВ. Во-первых, грубое вскрытие мыши выполняется для сбора любых соответствующих органов, таких как почки, печень и легкие. Затем мышиная аорта изолируется и иссекается от корня аорты до бедренной артерии. Затем две-три аорты объединяют и инкубируют в пищеварительном растворе перед ультрацентрифугированием для выделения интересующих ВВ. Затем потенциал минерализации электромобилей определяют путем инкубации в растворе с высоким содержанием фосфатов и измерения поглощения света на длине волны 340 нм. Наконец, коллагеновые гидрогели используются для наблюдения за образованием и созреванием кальцинированных минералов, производимых EV in vitro.
Introduction
Кальцификация является наиболее значимым предиктором смертности и заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями1. Кальцификация изменяет механику артериальной стенки из-за накопления кальциевых и фосфатных минералов2. При атеросклерозе кальцификация может усугубить местный стресс и привести к разрыву бляшек, что является основной причиной сердечных приступов. Медиальная кальцификация, часто возникающая в результате хронического заболевания почек, более распространена и приводит к значительной артериальной жесткости, дисфункции и перегрузке сердца 2,3. В настоящее время не существует терапевтических вариантов лечения или профилактики кальцификации сосудов.
Сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC) принимают остеобластоподобный фенотип и высвобождают кальцифицирующие внеклеточные везикулы (EV), которые зарождают зарождающиеся минералы, тем самым вызывая кальцификацию 4,5,6. Этот процесс напоминает физиологическую минерализацию остеобластов в кости7. Хотя конечная точка минерализации одинакова в сосудистой стенке и костном матриксе, механизмы, с помощью которых возникают кальцифицирующие EV, различаются в двух тканях8. Существует множество типов моделей, которые используются для изучения кальцификации сосудов. Модели клеточных культур in vitro имитируют остеогенный переход VSMC и последующее образование минералов со специализированными средами.
При изучении кальцификации in vivo используемая модель зависит от типа изучаемой кальцификации. Модели гиперлипидемических мышей часто используются для изучения атеросклеротической кальцификации, которая проявляется более фокальной в богатых липидами бляшках9. Напротив, медиальная кальцификация более распространена по всей сосудистой сети и часто изучается с использованием моделей хронической болезни почек, в которых используется режим диеты, богатый аденином, чтобы вызвать почечную недостаточность, или хирургические методы удаления значительных частей почек10,11. Агрессивные модели кальцификации сосудов использовали комбинацию моделей как гиперлипидемической, так и хронической болезни почек12. Этот протокол предоставляет метод оценки кальцификации сосудов в мышиных аортах как для медиальной, так и для атеросклеротической кальцификации, извлечения EV из стенки аорты и наблюдения за потенциалом минерализации в EV, полученных из моделей клеточных культур in vitro. Будущие исследования могут использовать эти процедуры в механистическом анализе кальцификации сосудов и для оценки потенциальных терапевтических вмешательств.
Protocol
Representative Results
Discussion
При выполнении протокола важно отметить критические шаги для получения успешных результатов. Во время изоляции мышиной аорты жизненно важно, чтобы перфузия выполнялась должным образом. При введении PBS необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проколоть правый желудочек. Это привед?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения (NIH) (1R01HL160740 и 5 T32GM132054-04) и Фонда исследований сердца Флориды. Мы хотели бы поблагодарить Кассандру Гомес за ее помощь в синтезе и визуализации гидрогелей.
Materials
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. . Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
