de vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析
Summary
本論文では、マウス大動脈を単離し、石灰化した細胞外小胞を抽出して石灰化の可能性を観察することにより、血管石灰化を取得および評価するための方法論を提示します。
Abstract
心血管疾患は世界の主要な死因であり、血管石灰化は心血管イベントの最も重要な予測因子です。しかし、現在、血管石灰化の治療または治療の選択肢はありません。石灰化は、カルシウムイオンとリン酸イオンを凝集させることによって核形成病巣として機能する特殊な細胞外小胞(EV)内で始まります。このプロトコルでは、マウス大動脈の石灰化を取得および評価し、関連する抽出されたEVを分析する方法について説明します。まず、マウスの肉眼的解剖を行い、腎臓、肝臓、肺などの関連臓器を採取します。次に、マウス大動脈を単離し、大動脈根から大腿動脈まで切除します。次に、2〜3個の大動脈をプールして消化液中でインキュベートした後、超遠心分離を受けて目的のEVを分離します。次に、EVの石灰化ポテンシャルは、高リン酸塩溶液中でインキュベートし、波長340nmの光吸光度を測定することによって決定されます。最後に、コラーゲンヒドロゲルを使用して、EVによって生成された石灰化したミネラルの形成と成熟を in vitroで観察します。
Introduction
石灰化は、心血管疾患の死亡率と罹患率の最も重要な予測因子です1。石灰化は、カルシウムとリン酸ミネラルの蓄積により動脈壁の力学を変化させます2。アテローム性動脈硬化症では、石灰化は局所的なストレスを悪化させ、心臓発作の主な原因であるプラーク破裂を引き起こす可能性があります。多くの場合、慢性腎臓病に起因する内側石灰化はより広範囲に及んでおり、重大な動脈硬化、機能障害、および心臓過負荷を引き起こします2,3。現在、血管石灰化の治療または予防のための治療選択肢はない。
血管平滑筋細胞(VSMC)は、骨芽細胞様表現型を採用し、新生ミネラルを核とする石灰化細胞外小胞(EV)を放出し、石灰化を促進します4,5,6。このプロセスは、骨7の骨芽細胞の生理学的石灰化に似ています。石灰化のエンドポイントは血管壁と骨基質で類似しているが、石灰化EVが発生するメカニズムは2つの組織で異なる8。血管石灰化の研究に使用されるモデルには多くの種類があります。in vitroでは、細胞培養モデルは、VSMCの骨形成移行とそれに続く特殊な培地によるミネラル形成を模倣しています。
in vivo石灰化を研究する場合、使用されるモデルは研究されている石灰化の種類によって異なります。高脂血症マウスモデルは、アテローム硬化性石灰化の研究によく使用され、これは脂質が豊富なプラーク内でより焦点が当てられているようです9。対照的に、内側石灰化は血管系全体でより広範囲に及んでおり、腎不全を誘発するためにアデニンが豊富な食事療法を採用する慢性腎臓病モデルまたは腎臓のかなりの部分を除去する外科的技術を使用して研究されることがよくあります10,11。血管石灰化の攻撃的なモデルは、高脂血症モデルと慢性腎臓病モデルの両方の組み合わせを使用しています12。このプロトコルは、内側およびアテローム硬化性石灰化の両方についてマウス大動脈の血管石灰化を評価し、大動脈壁からEVを抽出し、in vitro細胞培養モデルから得られたEVの石灰化の可能性を観察する方法を提供します。将来の研究では、血管石灰化の機構分析にこれらの手順を使用し、潜在的な治療介入を評価することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルを実行するときは、正常な結果を得るための重要な手順に注意することが重要です。マウス大動脈の単離中は、灌流が適切に行われることが重要です。PBSを注射するときは、右心室に穴を開けないように注意する必要があります。これにより、液体が心室から直接漏れ、肺を循環できず、大動脈内に血液が残ります。灌流が適切に行われ、微小解剖が開始されたら、完了してスキ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立心臓、肺、血液研究所(1R01HL160740および5 T32GM132054-04)およびフロリダ心臓研究財団からの助成金によって支援されました。ヒドロゲルの合成とイメージングを支援してくれたカサンドラ・ゴメスに感謝します。
Materials
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
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