Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.
A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.
A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares1. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato2. Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca 2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.
As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação 4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso7. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos8. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.
Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios9. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica12. Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.
Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começad…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01HL160740 e 5 T32GM132054-04) e da Fundação de Pesquisa do Coração da Flórida. Gostaríamos de agradecer a Kassandra Gomez por sua ajuda na síntese e imagem dos hidrogéis.
8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
10 mL Syringe | BD | 302995 | |
20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |