Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Summary

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Abstract

A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.

Introduction

A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares¹. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato². Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca ^2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.

As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação ^4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso⁷. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos⁸. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.

Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios⁹. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins^10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica¹². Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.

Protocol

O trabalho in vivo foi aprovado e supervisionado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida e em conformidade com as diretrizes atuais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Para este protocolo, o procedimento não difere dependendo da tensão, peso, idade e sexo do rato. O tipo de calcificação que está sendo estudada, dietas e tratamentos podem alterar a duração do estudo e o peso do camundongo usado e podem ser dependentes de uma cepa espec…

Representative Results

Uma vez extraídas as aortas, a imagem por meio de um scanner óptico infravermelho próximo mostra uma representação visual da aorta, bem como da calcificação vascular (Figura 1). Os valores de intensidade de pixel dentro da imagem fluorescente digitalizada representam a distribuição da calcificação e são mostrados aqui usando um mapa de calor colorido. Os métodos de quantificação incluem identificar um limiar positivo e relatar a área percentual da aorta com valores maiores qu…

Discussion

Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começad…

Materials

8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153