Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.
Abstract
Gentechnisch veränderte Mausmodelle in der Keimbahn (G-GEMMs) haben wertvolle Einblicke in die Funktion von In-vivo-Genen in Entwicklung , Homöostase und Krankheit geliefert. Der Zeit- und Kostenaufwand für die Gründung und Pflege von Kolonien ist jedoch hoch. Jüngste Fortschritte in der CRISPR-vermittelten Genom-Editierung haben die Erzeugung von somatischen GEMMs (S-GEMMs) ermöglicht, indem sie direkt auf die Zelle/das Gewebe/das Organ von Interesse abzielen.
Der Eileiter oder Eileiter beim Menschen gilt als Ursprungsgewebe des häufigsten Eierstockkrebses, des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms (HGSCs). HGSCs beginnen im Bereich des Eileiters distal der Gebärmutter, der sich neben dem Eierstock befindet, aber nicht im proximalen Eileiter. Traditionelle Mausmodelle von HGSC zielen jedoch auf den gesamten Eileiter ab und rekapitulieren daher nicht den menschlichen Zustand. Wir stellen eine Methode der DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Lösung (RNP) vor, die Mikroinjektion in das Lumen des Eileiters und die in vivo Elektroporation zur gezielten Ansprache von Schleimhautepithelzellen in begrenzten Regionen entlang des Eileiters. Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode für die Krebsmodellierung, wie z.B. 1) hohe Anpassungsfähigkeit bei der Ausrichtung auf den Bereich/das Gewebe/das Organ und die Region der Elektroporation, 2) hohe Flexibilität bei den Zielzelltypen (zelluläre Pliancy) bei Verwendung in Kombination mit spezifischen Promotoren für die Cas9-Expression, 3) hohe Flexibilität in der Anzahl der elektroporierten Zellen (relativ niedrige Frequenz), 4) Es ist keine spezifische Mauslinie erforderlich (immunkompetente Krankheitsmodellierung), 5) hohe Flexibilität bei der Kombination von Genmutationen und 6) Möglichkeit der Verfolgung elektroporierter Zellen in Kombination mit einer Cre-Reporterlinie. Somit rekapituliert diese kostengünstige Methode die Krebsentstehung beim Menschen.
Introduction
Der Eileiter, bei Mäusen Eileiter genannt, ist eine röhrenförmige Struktur, die die Gebärmutter mit dem Eierstock verbindet. Es spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortpflanzung von Säugetieren und bietet die Umgebung für die innere Befruchtung und die Präimplantationsentwicklung 1,2. Trotz seiner Bedeutung ist wenig über seine Funktion und Homöostase bekannt, was zum Teil auf die Entwicklung von In-vitro-Fertilisationstechniken zurückzuführen ist, die jedes Unfruchtbarkeitsproblem im Zusammenhang mit diesem Organ umgehen3. Es wurde jedoch festgestellt, dass präkanzeröse Läsionen des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms (HGSC), eines aggressiven Histotyps des Ovarialkarzinoms, der etwa 75 % der Ovarialkarzinome und 85 % der damit verbundenen Todesfälle ausmacht4, auf das distale Eileiterepithel beschränkt sind 5,6,7,8 . Dies deutet darauf hin, dass nicht alle Zellen in unserem Körper gleichermaßen anfällig für onkogene Beleidigungen sind, sondern dass nur einzelne/anfällige Zellen in jedem Gewebe/Organ zur Ursprungszelle von Krebs werden – als zelluläre Geschmeidigkeitbezeichnet 9. In diesem Sinne hat sich gezeigt, dass sich die Epithelzellen des distalen Eileiters, die sich neben dem Eierstock befinden, vom Rest des Eileiters unterscheiden10,11. Traditionelle Mausmodelle von HGSC, die auf alle Zellen im Eileiter abzielen, rekapitulieren daher nicht den menschlichen Zustand. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir eine Kombination aus CRISPR-vermittelter Genomeditierung, in vivo Eileiter-Elektroporation und Cre-basierter Abstammungsverfolgung verwendet, um HGSC erfolgreich zu induzieren, indem wir vier Tumorsuppressorgene im distalen Eileiter der Maus mutierten12,13. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das dieses Verfahren der Mikroinjektion und der In-vivo-Elektroporation beschreibt, um auf das Schleimhautepithel der Eileiterschleimhaut der Maus abzuzielen.
Diese Methode hat mehrere Vorteile. Es kann so angepasst werden, dass es auf andere Gewebe/Organe abzielt, einschließlich des Organparenchyms14. Obwohl andere In-vivo-Ansätze zur Genübertragung wie lentivirale und adenovirale Systeme verwendet werden können, um ein ähnliches gewebe-/organspezifisches Targeting zu erreichen, lässt sich der Bereich des Targetings leichter anpassen, indem verschiedene Größen von Pinzettenelektroden für die elektroporationsbasierte Verabreichung verwendet werden. Abhängig von der Konzentration von DNA/RNA/Ribonukleoproteinen (RNPs), den Elektroporationsparametern und der Größe der Elektroden kann die Anzahl der elektroporierten Zellen verändert werden. Darüber hinaus können bestimmte Zelltypen gezielt anvisiert werden, wenn sie in Kombination mit Promotoren für die Cas9-Expression verwendet werden, ohne dass gentechnisch veränderte Mausmodelle (G-GEMMs) in der Keimbahn erforderlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation im Gegensatz zu viralen Verabreichungssystemen die Verabreichung mehrerer Plasmide in einzelne Zellen und weniger Einschränkungen bei der Insert-DNA der Größe15. Auch das In-vivo-Screening von Genmutationen kann aufgrund dieser hohen Flexibilität relativ einfach durchgeführt werden. Weiterhin können elektroporierte Zellen verfolgt oder verfolgt werden, wenn diese Methode in Kombination mit Cre-Reporterlinien wie Tdtomato oder Confetti verwendet wird16,17.
Protocol
Die Tiere wurden in statischen Mikroisolationskäfigen mit Filteroberteilen untergebracht, die sich in einem speziellen Raum befanden, in dem sich eine Biosicherheitswerkbank vom Typ II befand. Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Tierpflegeausschuss der Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften der McGill University (AUP #7843) genehmigt.
1. Vorbereitung der Mikroinjektionsnadel
- Ziehen Sie ein Glaskapillarröhrchen mit einem Mikropipettenabzieher mit folgendem Programm in eine scharfe Spitze: P = 500, Hitze = 576, ZIEHEN = 50, VEL = 80, DEL = 70.
- Schneiden Sie mit einer sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze das spitze Ende des gezogenen Kapillarrohrs unter einem Präpariermikroskop ab, um eine Öffnung zu schaffen, wie in Abbildung 1A,B gezeigt. Achten Sie darauf, dass die Öffnung nicht zu groß ist, da dies den Eileiter beschädigt und eine langsame Injektion verhindert.
Abbildung 1: Herstellung der Mikroinjektionsnadel . (A,B) Gezogenes Kapillarrohr mit einem spitzen Ende (A), das abgeschnitten wurde, um eine Öffnung (B) zu schaffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Vorbereitung des Anästhetikums für die intraperitoneale Injektion
- Bereiten Sie am Tag der Operation gefiltertes, verdünntes Avertin vor. Avertin (2,2,2-tribromethanol)-Stammlösung wird in einer Konzentration von 1,6 g/ml in tert.-Amylalkohol durch kräftiges Rühren hergestellt und dunkel gelagert.
- Verdünnen Sie die Avertin-Stammlösung mit isotonischer Kochsalzlösung von 1,25 v/v-% auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml in einem Abzug. Wirbeln Sie das verdünnte Avertin und den Filter durch einen 0,22 μm Sterilfilter. Im Dunkeln aufbewahren.
3. Vorbereitung des Operationsbereichs
- Der Operationsbereich sollte eine spezielle sterile Umgebung sein, vorzugsweise eine saubere Bank oder eine Biosicherheitswerkbank. Ordnen Sie die sterilen Operationsgeräte, das Mikroskop, den Mikromanipulator und den Elektroporator nach Bedarf an. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Erhitzen Sie das Heizkissen/die Heizscheibe und legen Sie es unter einen sauberen, voll ausgestatteten Käfig. In diesem Käfig werden die Mäuse nach der Operation untergebracht.
- Gießen Sie sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine sterile Petrischale. Verwenden Sie eine saubere Schere, um saugfähiges Papier in Quadrate mit einer ungefähren Größe von 1 cm x 1 cm zu schneiden. Lassen Sie diese saugfähigen Papierstücke in das 1x PBS fallen, um sie einzuweichen.
4. Vorbereitung der Lösung und der Nadel für die Injektion
- Bereiten Sie die Injektionslösung am Tag der Operation vor. Mischen Sie die DNA/RNA/RNPs mit gefiltertem Trypanblau bis zu einer Mindestendkonzentration von jeweils 200 ng/μl bzw. 5%. Vor der Injektion bei Raumtemperatur lagern.
Anmerkungen: Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um 100 % Trypanblau aufzunehmen, und filtern Sie sie vor der Verwendung durch einen 0,22 μm sterilen Filter. - Befestigen Sie die gezogene Kapillarnadel, die im Folgenden als Mikroinjektionsnadel bezeichnet wird, an dem Mikromanipulator mit Klemmhalterung, der durch eine magnetische Halterung stabilisiert wird (Aufbau in Abbildung 2B gezeigt).
- Pipettieren Sie 2 μl der Injektionslösung in eine sterile Petrischale. Nehmen Sie bei der Beobachtung unter dem Mikroskop langsam 1-2 μl dieser Lösung mit der am Mikromanipulator angebrachten Luftdruckspritze in die Mikroinjektionsnadel auf. Vermeiden Sie Blasen/Aufnahme von Blasen in die Mikroinjektionsnadel.
Abbildung 2: Vorbereitung des Operationsbereichs . (A) Einrichtung des Operationsbereichs in einer sauberen Bank. (B) Präpariermikroskop und Mikromanipulator für Rechtshänder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Freilegung des weiblichen Fortpflanzungstraktes
- Betäuben Sie eine 6-8 Wochen alte weibliche Maus durch intraperitoneale Verabreichung von gefiltertem, verdünntem Avertin (Anästhetikum) in einer Dosis von 0,25-0,5 mg/g. Anschließend wird Carprofen (präemptives Analgetikum) subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht.
Anmerkungen: Andere Alternativen, die als Anästhetikum verwendet werden können, sind Isofluran oder Ketamin/Xylazin. - Legen Sie saugfähiges Papier auf ein sauberes, beheiztes Pad/eine Disc. Legen Sie dann die betäubte Maus mit der Rückenseite nach oben auf dieses erhitzte, saugfähige Papier. Tragen Sie Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern.
Anmerkungen: Vergewissern Sie sich, dass sich das Heizkissen/die Heizscheibe leicht warm anfühlt, indem Sie es mit dem Handrücken testen. - Testen Sie auf einen tiefen Betäubungsstillstand, indem Sie den Zeh der betäubten Maus mit einer Pinzette einklemmen. Entfernen Sie das Rückenfell um die prospektive Inzisionsstelle (in Abbildung 3A gezeigte Stelle) und wischen Sie die nackte Haut mit einem Antiseptikum ab.
- Verwenden Sie eine gerade stumpfe Pinzette, um die nackte Haut zu kneifen und mit einer sterilen, scharfen, stumpfen Schere einen 1 cm langen Schnitt entlang der Körpermittellinie zu machen. Reinigen Sie den Bereich um den Einschnitt mit einem Antiseptikum.
- Drücke eine Seite der Schnittstelle zusammen und halte sie mit einer sterilen Adson-Pinzette hoch. Trennen Sie dann mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette die Haut vorsichtig von der Körperwand, beginnend am Mittellinienschnitt und seitlich bewegend.
- Lokalisieren Sie das Fettpolster unterhalb der Niere. Kneifen Sie mit einer sterilen, geraden, stumpfen Pinzette die Körperwand direkt über dem Fettpolster zusammen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperwand mit einer sterilen, scharfen Präparierschere und achten Sie darauf, Blutgefäße zu vermeiden.
- Während Sie die Körperwand immer noch mit einer geraden stumpfen Pinzette einklemmen, führen Sie ein Paar sterile, stumpfe, gebogene Pinzetten in den Einschnitt ein und erweitern Sie den in der Körperwand entstandenen Einschnitt.
- Fassen Sie das sichtbare Fettpolster mit der stumpfen gebogenen Pinzette und ziehen Sie es aus dem Loch, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter freizulegen.
- Um den Fortpflanzungstrakt freizulegen, klemmen Sie das Fettpolster mit einer sterilen Bulldoggenklemme fest, wie in Abbildung 3B gezeigt.
6. In-vivo-Eileiterinjektion und Elektroporation
- Legen Sie das erhitzte saugfähige Papier und die betäubte Maus mit freiliegendem Fortpflanzungstrakt vorsichtig auf den Tisch eines Präpariermikroskops, so dass der Trakt beobachtet werden kann. Ein Beispiel für die unter dem Mikroskop beobachtete Ansicht ist in Abbildung 3B dargestellt.
- Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Injektionsnadel mit Lösung auch unter dem Mikroskop beobachtet werden kann.
- Halten Sie mit einer sterilen, sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze den Bereich des Eileiters, der injiziert werden soll, ruhig. Der zu injizierende Bereich muss mit der Richtung der Mikroinjektionsnadel übereinstimmen.
Anmerkungen: Verwenden Sie die Bulldoggenklemme, mit der das Fettpolster und der Fortpflanzungstrakt verankert sind, um den Trakt bei Bedarf vorsichtig in eine optimale Position zu drehen/zu bewegen. - Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass der Eileiter mit der Mikroinjektionsnadel punktiert wird, während Sie gleichzeitig den Eileiter mit der sich verjüngenden ultrafeinen Spitzenzange auf die Nadel führen. Bewegen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig, um zu bestätigen, dass sie in den Eileiter eingeführt wurde.
Anmerkungen: Führen Sie die Mikroinjektionsnadel in ein gerades Segment und nicht in einen Wendepunkt des gewickelten Eileiters ein, um mehrfache Einstiche und das Auslaufen der Injektionslösung zu vermeiden. - Injizieren Sie langsam bis zu 1 μl Lösung in den Eileiter, während Sie die Bewegung der blauen Lösung und die Ausdehnung des Eileiterlumens unter dem Mikroskop beobachten. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in das Lumen gelangen. Repräsentative Bilder von Eileitern, die mit 100 % Trypanblau injiziert wurden, sind in Abbildung 3C,D dargestellt.
- Entfernen Sie die Nadel aus dem Eileiter. Decken Sie den Zielbereich mit einem Stück saugfähigem Papier ab, das in sterilem 1x PBS (ab Schritt 3.3) eingeweicht ist.
- Fassen Sie das vorgetränkte Papier und den Bereich/die Region, die anvisiert werden soll, mit einer Elektrodenpinzette (1 mm, 3 mm oder 5 mm, je nach Größe des zu behandelnden Bereichs) und ziehen Sie ihn vom Körper weg, bevor Sie mit den folgenden Einstellungen am Impulsgeber/Elektroporator elektropieren: 30 V, drei Impulse, 1 s Intervall, 50 ms Pulslänge, unipolar.
Anmerkungen: Der Abstand zwischen den Elektroden sollte so eingestellt werden, dass sich die Elektroden an der Zielregion festklemmen können, ohne den Eileiter zu verformen. Der empfohlene Abstand beträgt ca. 1 mm. - Entfernen Sie nach der Elektroporation das saugfähige Papier und legen Sie die Maus (mit dem erhitzten saugfähigen Papier darunter) wieder auf ein Wärmekissen. Lösen Sie die Bulldoggenklemme und schieben Sie den freiliegenden Fortpflanzungstrakt vorsichtig wieder unter die Körperwand. Wiederholen Sie Abschnitt 5, um den Fortpflanzungstrakt auf der anderen Seite freizulegen.
HINWEIS: Die Elektroporation ist unabhängig vom Brunststadium der Maus erfolgreich, solange das Lumen mit der Lösung gefüllt ist. - Decken Sie den freiliegenden Trakt mit saugfähigem Papier ab, das in sterilem 1x PBS vorgetränkt ist, um ein Austrocknen zu verhindern, und bereiten Sie dann die Mikroinjektionsnadel für die zweite Injektion vor, indem Sie die Schritte 4.2 und 4.3 wiederholen.
Anmerkungen: Ersetzen Sie die Mikroinjektionsnadel nach Bedarf. Verhindern Sie das Austrocknen des freiliegenden Gewebes, indem Sie bei Bedarf steriles 1x PBS auftragen. - Wiederholen Sie die obigen Schritte, um den Eileiter auf der gegenüberliegenden Seite zu injizieren und zu elektroporieren.
Anmerkungen: Tragen Sie das Augengleitmittel während und nach der Operation nach Bedarf erneut auf. - Nachdem beide Eileiter elektroporiert und wieder unter die Körperwand gelegt wurden, nähen oder klammern Sie die dorsale Inzisionsstelle. Fassen Sie zum Nähen mit einem Hämostat die Nadel der seidengeflochtenen Nähte (3/8 Kreis; Maschenweite: 5-0; Nadelstärke: 18 mm; Fadenlänge: 75 cm). Drücken und halten Sie eine Seite der Schnittstelle mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette zusammen und halten Sie sie hoch, und verwenden Sie dann das Hämostat, um die Naht zu manipulieren und die Wunde zu schließen.
- Bewegen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf ein beheiztes Pad/eine beheizte Disc (aus Schritt 3.2) gelegt wird, und überwachen Sie, bis die Maus aktiv ist.
- Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen in den nächsten 3 Tagen alle 24 Stunden subkutan und überwachen Sie es in den nächsten 10 Tagen.
Abbildung 3: Exposition des weiblichen Fortpflanzungstrakts und Mikroinjektion . (A) Lage des Mittellinienschnitts (dargestellt als gelbe Linie) auf der dorsalen Seite einer Rosa-LSLtdTomato-Maus. (B) Exposition des weiblichen Fortpflanzungstrakts. Das Fettpolster wurde mit einer sterilen Bulldoggenklemme geklemmt, um den Trakt zu verankern und freizulegen. (C,D) Repräsentative Bilder der In-vivo-Eileiterinjektion . Eine Mikroinjektionsnadel wurde in die distale Ampulle eingeführt (mit AMP gekennzeichnet) und filtriertes 100%iges Trypanblau wurde in das Lumen des Eileiters injiziert, während der Trakt freigelegt wurde (C). Repräsentatives Bild eines präparierten Eileiters, das zeigt, dass sich die injizierte Trypanblaulösung im distalen und proximalen Eileiterlumen (D) verteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Representative Results
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Vorbereitung der Mikroinjektionsnadel bzw. den Aufbau des Operationsbereichs für die In-vivo-Mikroinjektion bzw. die Elektroporation des Maus-Eileiters. Während der Operation wurde der weibliche Fortpflanzungstrakt durch Schnitte in der Rückenhaut (Abbildung 3A) und der Körperwand einer betäubten Rosa-LSLtdTomate (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 Maus freigelegt. Eine Bulldoggenklemme wurde auf das Fettpolster über dem Trakt geklemmt, um es freizulegen und zu verankern (Abbildung 3B). Eine Injektionslösung, die PCS2 CreNLS-Plasmide18 in einer Konzentration von 400 ng/μl enthielt, wurde in die Ampulle (mit AMP gekennzeichnet) des gewundenen Eileiters injiziert und verteilte sich im gesamten Lumen des Eileiters (Abbildung 3C, D). Obwohl in diesem Manuskript PCS2-CreNLS-Plasmide verwendet wurden, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen, kann die beschriebene Methode mit leicht austauschbaren DNA/RNA/RNPs in der Injektionslösung für die CRISPR/Cas-vermittelte Geneditierung im Eileiter der Maus verwendet werden. Dann wurden 1 mm oder 3 mm Pinzettenelektroden so positioniert, dass sich der distale Eileiter zwischen den Elektroden für die elektroporationsbasierte Abgabe befand.
Die Eileiter wurden 4 Tage nach der Operation entnommen und durch Entfernung des Mesosalpinx gedehnt, um die Spezifität der Elektroporation zu visualisieren. Mit Hilfe von 1 mm oder 3 mm Pinzettenelektroden wurde der mit TdTomato markierte Zielbereich auf das distale Eileiterepithel beschränkt (Abbildung 4A, D). Die Größe dieses Zielbereichs wurde durch den Einsatz von Elektroden unterschiedlicher Größe weiter kontrolliert. Mit 3-mm-Pinzettenelektroden zielten wir auf einen viel größeren Bereich des AMP (Abbildung 4B, C), als nur auf die distale Spitze, die INF (Abbildung 4E, F), mit 1-mm-Pinzettenelektroden. Diese entnommenen Eileiter wurden fixiert, mit einem Saccharosegradienten behandelt und mit einem Kryostaten für detaillierte Analysen geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hoescht 33342 und Phalloidin gegengefärbt, um die Zellkerne bzw. das Zytoskelett zu färben, und dann mit einem konfokalen Punktrastermikroskop abgebildet. In der Zielregion wurden elektroporierte Zellen, die durch TdTomato markiert waren, zufällig auf nicht-elektroporierte (TdTomato-ve) Zellen verteilt (Abbildung 4G). Darüber hinaus waren elektroporierte Zellen auf das Schleimhautepithel beschränkt und nicht in der darunter liegenden Stroma- oder Muskelschicht zu finden (Abbildung 4G,H). Um die CRISPR-Cas-vermittelte Geneditierung zu bestätigen, können TdTomato+ve-Zellen schließlich durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur DNA-Isolierung und MiSeq-Sequenzierung isoliert werden12.
Abbildung 4: Validierung der erfolgreichen In-vivo-Injektion und Elektroporation von Eileiterepithelzellen, 4 Tage nach der Operation. (A-C) Elektroporation mit 3 mm großen Pinzettenelektroden. Der Eileiter wurde abgewickelt, indem der Mesosalpinx entfernt wurde, um die Spezifität der Elektroporation besser sichtbar zu machen (A). Der durch die TdTomato-Expression identifizierte Elektroporationsbereich war auf den distalen Eileiter beschränkt, der als AMP (B,C) gekennzeichnet war. (D-F) Elektroporation mit 1 mm großen Pinzettenelektroden. Der Eileiter wurde abgewickelt, indem der Mesosalpinx entfernt wurde, um eine bessere Visualisierung der Elektroporationsspezifität zu ermöglichen (D). Der Bereich der Elektroporation beschränkte sich auf das Infundibulum (INF), die distale Spitze des Eileiters (E,F). (G,H) Querschnitt des distalen Eileiters 4 Tage nach Elektroporation mit PCS2 CreNLS-Plasmiden. Elektroporierte Zellen, die mit TdTomato (G) markiert waren, waren auf die epitheliale Monoschicht (H) beschränkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Entscheidende Schritte in diesem detaillierten Protokoll sind die Mikroinjektion der DNA/RNA/RNP-Lösung in das Lumen des Eileiters und die Kontrolle der Stärke und Fläche der Elektroporation. Das Austreten von DNA/RNA/RNP-Lösung während der Mikroinjektion kann zu einer Transfektion unerwünschter Bereiche/Zellen führen. Für eine gleichmäßige und effiziente Elektroporation ist es vorzuziehen, das Lumen des Eileiters mit der Lösung zu füllen (Abbildung 3C,D). Dies liegt daran, dass der Bereich der Elektroporation hauptsächlich durch die Elektrodengröße und -platzierung gesteuert wird. Eine schwache Elektroporation verringert die Anzahl der elektroporierten Zellen, und eine starke Elektroporation kann die Elektroporation unerwünschter Zellen verursachen oder die Gewebestruktur stören. Die Anzahl der elektroporierten Zellen kann durch Einstellen der DNA/RNA/RNP-Lösungskonzentration oder der Elektroporationsparameter variiert werden. Da jedoch hohe Spannungen/Wärmeentwicklung während der Elektroporation das Gewebe schädigen können, sollten diese Parameter vor der Anwendung an lebenden/anästhesierten Mäusen getestet werden. Schließlich wird aufgrund des anspruchsvollen Charakters dieses Verfahrens empfohlen, die Exposition des Trakts und die Mikroinjektion an toten Mäusen zu üben, bevor diese Operation an lebenden/anästhesierten Mäusen durchgeführt wird.
Es ist bekannt, dass mehrere Gene an der Krebsentstehung beteiligt sind, so dass die Rekapitulation dieses Ereignisses eine multiallelische Modifikation mehrerer Gene erfordert. Darüber hinaus ist auch bekannt, dass nicht alle Zellen gleichermaßen anfällig für onkogene Mutationen sind9. Die Krebsmodellierung erfordert daher spezifische Cre-Mauslinien, um eine genaue Kontrolle der onkogenen Insulte zu erreichen. Ihre Verfügbarkeit und Spezifität bringt jedoch verschiedene Herausforderungen mit sich, darunter Auswirkungen auf nicht zielgerichtete Gewebe und Letalität19. Darüber hinaus verursachen herkömmliche G-GEMMs hohe Wartungskosten und benötigen Zeit für die Mauslinienerstellung. Die Entwicklung der CRISPR/Cas9-Genom-Editierungstechnologie und die Verbesserung der Genübertragung in bestimmte somatische Zellen haben es uns ermöglicht, diese Probleme zu überwinden. In diesem Protokoll stellen wir eine DNA/RNA/RNP-Verabreichungsmethode für die somatische Genommanipulation vor, die für die Krebsmodellierung verwendet werden kann, ohne dass unbedingt spezifische Mauslinien erforderlich sind12. Durch die Injektion von DNA/RNA/RNP-Lösungen in das Lumen und die Verwendung unterschiedlich großer Pinzettenelektroden für die elektroporationsbasierte Verabreichung werden eingeschränkte Bereiche des Eileiterschleimhautepithels der Maus anvisiert (Abbildung 4A-F). Dies ist besonders nützlich bei der Modellierung der Initiierung von HGSCs, die vom distalen Ende des Eileiters ausgehen.
Die vorgestellte Mikroinjektions- und In-vivo-Elektroporationsmethode ist sehr vielseitig einsetzbar, um Gewebe/Organe mit einem Lumen gezielt zu erreichen. Auch das Organparenchym kann mit dieser Methode angegriffen werden14. Virale Verabreichungsansätze, wie lentivirale und adenovirale Systeme, können ebenfalls für ähnliche Zwecke verwendet werden. Die Vorteile der Elektroporation gegenüber viralen Verabreichungsansätzen sind jedoch: 1) mehrfache Plasmidabgabe in einzelne Zellen, 2) keine Beschränkung der Insertgröße15 und 3) einfache Kontrolle des Bereichs und des Zeitpunkts der Verabreichung. Darüber hinaus kann die Targeting-Spezifität durch die Verwendung von linienspezifischen Promotoren verbessert werden. Dies ist bei viralen Systemen manchmal schwierig, da die Virusverpackung begrenzt ist.
Wie es in der Natur der Elektroporation liegt, werden elektroporierte Epithelzellen zufällig mit gesunden, unbearbeiteten Zellen durchsetzt (Abbildung 4G). Dieser Mosaizismus in genetisch veränderten und unveränderten Zellen könnte jedoch für die Untersuchung der Krebsentstehung von Vorteil sein, da er die sporadische Natur der frühen Krebsentstehung in einer immunkompetenten Mikroumgebung rekapituliert. Die Frequenz der elektroporierten Zellen kann durch Variation der DNA/RNA/RNP-Lösungskonzentrationen und/oder Elektroporationsparameter eingestellt werden. Durch die Verwendung von CRISPR-Cas-vermittelter Genom-Editierung in Kombination mit dem vorgestellten Protokoll ist es einfach, mehrere Gene zu screenen und heterogene Muster von Mutationen/Allelkombinationen in Zielgenen zu erzeugen. Dies ist besonders nützlich bei der Modellierung von Krebserkrankungen, die eine beträchtliche Anzahl genomischer Veränderungen aufweisen, wie z. B. HGSCs20,21. Darüber hinaus ist es möglich, durch die Sequenzierung gezielter Gene während der Krebsprogression die klonale Evolution von Tumoren und Metastasen in immunkompetenten Mäusen zu verfolgen12.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Katie Teng und Dr. Matthew J. Ford für die Bereitstellung von Plasmiden, die zur Generierung repräsentativer Ergebnisse und zur Protokolloptimierung verwendet werden. K.H. wurde durch das Promotionsstipendium des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), die Donnor Foundation, das Delta Kappa Gamma World Fellowship, das Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin und Alexander McFee unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
| 1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
| 1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
| 3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
| 30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
| Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
| Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
| Analgesic | - | - | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
| Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) - Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
| Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
| Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
| Eye lubricant | Alcon | - | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
| Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
| Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
| Heating pad/disc | - | - | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
| Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
| Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
| Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
| Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
| Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
| Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
| Shaver | - | - | Hair removal cream can also be used. |
| Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
| Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
| Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |
References
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