Summary
We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.
Abstract
Van geleedpotigen is bekend dat ze een verscheidenheid aan virussen van medisch en agrarisch belang overbrengen via hun hemolymfe, wat essentieel is voor virusoverdracht. Hemolymfeverzameling is de basistechnologie voor het bestuderen van virus-vectorinteracties. Hier beschrijven we een nieuwe en eenvoudige methode voor de kwantitatieve verzameling van hemolymfe van kleine geleedpotigen met behulp van Laodelphax striatellus (de kleine bruine planthopper, SBPH) als een onderzoeksmodel, omdat deze geleedpotige de belangrijkste vector is van het rijststreepvirus (RSV). In dit protocol begint het proces door voorzichtig een been van de bevroren geleedpotige af te knijpen met een pincet met een fijne punt en de hemolymfe uit de wond te drukken. Vervolgens wordt een eenvoudige micropipette bestaande uit een capillair en een pipetbol gebruikt om de transudatieve hemolymfe uit de wond te verzamelen volgens het principe van capillaire krachten. Ten slotte kan de verzamelde hemolymfe worden opgelost in een specifieke buffer voor verder onderzoek. Deze nieuwe methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen is een nuttig en efficiënt hulpmiddel voor verder onderzoek naar arbovirussen en vector-virus interacties.
Introduction
Zowel dierlijke als plantaardige virussen kunnen worden overgedragen door geleedpotigen, en deze virussen vormen een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid en veroorzaken enorme economische verliezen in de landbouw 1,2,3. Belangrijk is dat de geleedpotige hemolymfe, die dient als de bloedsomloop en een vitaal element van het immuunsysteem in geleedpotigen, een belangrijke rol speelt bij het reguleren van arbovirale transmissie. Virussen verkregen via de geleedpotige darmen worden pas naar andere weefsels getransporteerd nadat ze met succes zijn ontsnapt aan de ongunstige hemolymfeomgeving 4,5,6,7. De levenscyclus van virussen in de geleedpotige hemolymfe omvat virusoverleving in het vloeibare plasma, binnenkomst in de hemocyt en transport naar andere weefsels, en verschillende virus-vectorinteractiemechanismen treden op in de hemolymfe 8,9,10,11,12. De verticale transmissie van RSV door de SBPH is bijvoorbeeld afhankelijk van een moleculaire interactie tussen het SBPH-vitellogenine-eiwit en het RSV-capside-eiwit (rijststreepvirus)13,14. Sommige virussen kunnen ontsnappen aan de immuunrespons van de hemolymfe door specifieke vectorfactoren te binden15,16,17,18. Daarom is het onderzoeken van vector-virusinteracties in de hemolymfe van geleedpotigen belangrijk voor het ontwikkelen van een beter begrip van arbovirusoverdracht.
De hemolymfe van sommige kleine insecten, zoals planthoppers, leafhoppers en sommige muggen, is moeilijk te verzamelen vanwege hun grootte. Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende methoden ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen, waaronder het rechtstreeks inbrengen van een spuitnaald in het insectenlichaam om een microvolume van de hemolymfe te extraheren, het verzamelen van exsudaat van de wondplaats met een pincet met een fijne punt en directe centrifugatie. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om relatieve genexpressieniveaus en virale titers binnen de hemolymfe 19,20,21 te meten. Een effectieve methode voor het kwantificeren van het hemolymfevolume, die nodig is voor het tellen van hemocyten, eiwitkwantificering en enzymactiviteitsanalyse, is momenteel echter niet beschikbaar voor deze kleine insecten.
De SBPH (kleine bruine planthopper) is een soort kleine insectenvector met een lichaamslengte van ongeveer 2-4 mm. De SBPH is in staat om een verscheidenheid aan plantenvirussen over te brengen, waaronder RSV, maïs ruw dwergvirus en rijstzwart gestreept dwergvirus22,23,24. De interactie tussen de SBPH en RSV is het afgelopen decennium diepgaand bestudeerd. Om het werken met SBPHs te vergemakkelijken, hebben we een nieuwe en eenvoudige methode ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen. Deze methode, die is gebaseerd op het principe van capillaire krachten, maakt gebruik van een capillair met een schaalmarkering om de hemolymfe van het insect op een nauwkeurige en kwantificeerbare manier te verkrijgen. Dit stelt ons in staat om een specifiek volume hemolymfe van kleine insecten efficiënt te verzamelen en de hemolymfe-omgeving van kleine vectoren in meer detail te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insecten kweken
- Verhoog de SBPHs die in dit experiment worden gebruikt in rijstzaailingen (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 rijstzaailingen in een incubator (65 mm x 200 mm) en groei bij 25 °C onder een 16 h lichte/8 h donkere fotoperiode.
2. Dissectie van de SBPHs voor hemolymfeverzameling
- Doe de SBPHs in een centrifugebuis en plaats ze 10-30 minuten in een ijsbad.
OPMERKING: Plaats de SBPHs niet minder dan 10 minuten in het ijsbad, anders kunnen de insecten herleven. - Plaats een bevroren SBPH op een glazen plaat (zie Materiaaltabel) onder een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) met de buik naar boven gericht. Pas de focus aan op de zes poten van het insect.
- Bereid twee uiterst nauwkeurige pincetten (zie Materiaaltabel) met ultrafijne uiteinden. Gebruik een pincet om op het lichaam van het insect te drukken om het op zijn plaats te houden en gebruik het andere pincet om voorzichtig een van de poten van het insect te trekken.
OPMERKING: Voor insecten met een harde schaal kan een oogheelkundig scalpel worden gebruikt voor het afsnijden van een van de benen. - Druk zachtjes op de borst van het insect met een pincet om de hemolymfe door de wond naar buiten te laten stromen.
OPMERKING: De hemolymfe presenteert zich als transparante druppels zonder zichtbare witte vlok. Gooi het lipide weg als er een witte vlok is, die vetlichaamsbesmetting vertegenwoordigt.
3. Hemolymfe collectie met behulp van micropipettes
- Maak een micropipette. Plaats een capillaire buis (zie materiaaltabel) met een volume van 1 μl in de pipetbol (zie materiaaltabel). Voor nauwkeurige metingen moet u ervoor zorgen dat de schaallijn zichtbaar is.
OPMERKING: Een klein gaatje aan de bovenkant van de pipetbol is noodzakelijk. - Houd bij het verzamelen van de hemolymfe de pipetbol van de micropipette vast en plaats de capillaire buis dicht bij de insectenwond. Verzamel de hemolymfe die uit de wond komt door eenvoudig de punt van het capillair aan de hemolymfe aan te raken.
- Blokkeer het kleine gaatje aan de bovenkant van de pipetbol iets met de vinger om het absorptieproces te stoppen wanneer de vloeistof in de capillaire buis de gewenste schaallijn bereikt.
OPMERKING: Verzamel onophoudelijk en snel een monster van 1 μL hemolymfe om lipidebesmetting en buisverstopping te voorkomen. - Druk op de pipetbol om de verzamelde hemolymfe af te voeren in 100 μL PBS-buffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
OPMERKING: De capillaire buis wordt in de PBS-buffer ingebracht. - Verander naar een nieuwe capillaire buis bij het verzamelen van nog eens 1 μL monster van hemolymfe.
4. Coomassie Blauwe beits
- Verzamel 3 hemolymfemonsters met hetzelfde volume (1 μL) van larven in het 3e stadium volgens de protocollen beschreven in stap 3 en voer de verzamelde hemolymfe af in de PBS-buffer om een totaal volume van 100 μL te maken.
- Voeg 25 μL 5x eiwitbelastingbuffer (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glycerol, 5% W/V β-mercaptoethanol) toe aan 100 μL van de verdunde hemolymfemonsters en verwarm om de eiwitten te denatureren.
- Laad 20 μL van de gekookte monsters op een 10% SDS-PAGE eiwitgel (zie tabel met materialen) om de eiwitten te scheiden.
- Kleur de gel in een Coomassie Blue-oplossing (meng 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 met 250 ml isopropanol, 100 ml ijsazijn en 650 ml ddH2O en filter eventuele deeltjes uit met filterpapier) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en ontkleur de gel vervolgens gedurende 1 uur met ontkleuringsoplossing (100 ml azijnzuur, 400 ml methanol, 500 ml ddH2O).
5. Bepaling van de eiwitconcentratie
- Verdun 10 mg/ml runderserumalbumine (BSA) tot 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml en 0,3125 mg/ml met PBS-buffer met behulp van de tweevoudige verdunningsmethode.
- Zuig 5 μL PBS-buffer en elke concentratie BSA-oplossingen in stap 5.1 aan, voeg 1 ml 1x Bradford-kleurstofreagens toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik PBS-buffer in Bradford-kleurstofreagens als controle en nul bij OD = 595 nm. Meet de absorptiewaarden van elk van de resterende eiwitconcentraties en maak een standaardcurve.
- Voeg 1 μL hemolymfe van larvale, vrouwelijke of mannelijke SBPHs toe aan 100 μL PBS-buffer en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 100 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C om de hemocyten te verwijderen.
- Zuig 90 μL supernatant op een nieuwe centrifugebuis en meet de absorptiewaarden van het supernatant volgens de instructies in stap 5.2.
- Bereken de eiwitconcentraties van de hemolymfemonsters volgens de regressievergelijking van de standaardcurve. Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in de experimenten.
6. Microscopische detecties
- Gebruik micropipetten om hemolymfe te verzamelen van 10-15 SBPHs in verschillende ontwikkelingsstadia. Voeg de verzamelde hemolymfe toe aan een buis met 20 μL 4% paraformaldehyde-oplossing (zie materiaaltabel). Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de hemolymfe te fixeren.
- Pipetteer 20 μL vaste hemocyten op het midden van een met silaan bekleed glaasje (zie materiaaltabel).
- Droog de druppel op in een schuifdroogrek.
OPMERKING: Vermijd overmatig drogen. - Bedek het monster met goudantifade-reagens 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (zie materiaaltabel) en inspecteer de dia onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel).
7. Celkwantificering
- Verzamel 1 μL hemolymfe uit de SBPHs met een micropipette en los het op in 20 μL PBS-buffer.
- Verdun de hemolymfemonsters vijfvoudig met PBS-buffer.
- Pipetteer 20 μL hemolymfeoplossing in het midden van de celtelkamer (zie materiaaltabel). Bedek de druppel met een coverslip (zie Materiaaltabel).
- Tel de cellen in de vijf vierkanten op de celtelkamer (aanvullende figuur 1), onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel). Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in elk van de experimenten.
Cellen/μL = totaal aantal van vijf middelste kwadraten × 5 × verdunningsfactor × 104
8. Statistische analyses
- Voer statistische analyses uit met de bijbehorende software (zie Materiaaltabel). Maak een nieuw bestand en selecteer de kolom, importeer de gegevens en genereer een spreidingsplot met een balk.
- Bereken het gemiddelde en de SD voor elke groep gegevens met behulp van kolomstatistieken en gebruik een eenrichtings-ANOVA-tool om de significantie van de verschillen tussen de groepen te evalueren. Bepaal het gemiddelde en de SD van drie biologische replicaties met drie onafhankelijke experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micropipette model en hemolymfe collectie
We hebben een eenvoudige micropipette ontwikkeld waarvan de werking gebaseerd is op de capillaire krachten van de capillaire buis. De micropipette bestaat uit een capillaire buis en een pipetbol (figuur 1A). Capillaire buizen zijn verkrijgbaar in verschillende volumegroottes, variërend van 1 μL tot 20 μL, en de capillaire buisvolumes worden geselecteerd op basis van de vereisten. Capillaire buizen met kleinere volumes worden niet voorgesteld omdat de extra fijne openingen van buizen met een kleiner volume het moeilijk kunnen maken om vloeistof zoals hemolymfe te absorberen. De pipetlamp bevat een gat aan de bovenkant dat niet kan worden gedicht tijdens de hemolymfeverzameling. Deze pipetbol is handig voor het vasthouden van de micropipette tijdens het verzamelen van vloeistof (figuur 1B) en helpt ook bij het overbrengen van de verzamelde vloeistof van de capillaire buis naar de opvangbuffer.
Om hemolymfe gemakkelijk te verzamelen, werden de SBPHs in dit werk eerst ingevroren in ijs of in de koelkast. Deze bevroren SBPHs werden vervolgens gelokaliseerd op een dia onder een stereomicroscoop en een van de poten van elke SBPH werd eraf getrokken met een pincet met een fijne punt (figuur 1C). Om een grote wond en een optimale hemolymfeverzameling te garanderen, is het het beste om het been bij de wortel af te trekken (figuur 1Ca, b). Om het risico op besmetting door het vetlichaam te minimaliseren, werden alleen heldere vloeibare druppels zonder witte vlok verzameld (figuur 1cc). De micropipette werd gebruikt om de gewenste volumes hemolymfe te absorberen (figuur 1Cd). Om 1 μL hemolymfe te verzamelen, moesten ongeveer 30-40 larvale SBPHs of 8-15 volwassen SPBHs worden ontleed.
Analyse van de verzamelde hemolymfe
Om de nauwkeurigheid van de micropipette te beoordelen als een methode voor het evalueren van het volume van de verzamelde hemolymfe, hebben we de eiwitconcentraties van verschillende monsters getest. Hemolymfe uit larven werd verzameld met behulp van een micropipette met een capillair volume van 1 μL, en drie eiwitmonsters werden afzonderlijk verzameld en getest met behulp van een SDS-PAGE-gel. De resultaten toonden aan dat de hoeveelheid eiwit in de drie banen bijna gelijk was (figuur 2A). Voor larven was het totale eiwitgehalte 3,707 mg / ml ± 1,382 mg / ml. We verzamelden ook hetzelfde volume hemolymfe van volwassen vrouwelijke en mannelijke SBPHs, en deze vertoonden eiwitconcentraties van respectievelijk 3,515 mg / ml ± 1,400 mg / ml en 3,621 mg / ml ± 0,860 mg / ml (tabel 1). Er waren geen significante verschillen in het eiwit tussen de drie monsters (figuur 2B).
Daarnaast observeerden we ook de hemocyten in de verzamelde larvale hemolymfe om de kwaliteit en zuiverheid van de hemolymfemonsters te beoordelen. De hemocyten varieerden in grootte tussen 2-20 nm en er werd geen vetlichaam gedetecteerd (figuur 2C). De meerderheid van de geïdentificeerde cellen waren plasmatocyten, variërend van 5-15 nm in diameter en verschenen vaak in aggregaten25. Vervolgens telden we de celconcentraties van de hemolymfe van larven, volwassen vrouwtjes en volwassen mannetjes, en de geïdentificeerde celconcentraties waren respectievelijk 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL en 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL (tabel 2). Het aantal hemocytencellen in de larven, volwassen vrouwtjes en volwassen mannetjes vertoonde geen significante verschillen (figuur 2D). Deze resultaten geven aan dat de micropipette-verzamelmethode een betrouwbare en nauwkeurige manier is om hemolymfe van SBPHs te verzamelen.
Figuur 1: Schema van het micropipetmodel en de hemolymfeverzameling. (A) Samenstelling van de micropipet. De micropipette bestaat uit een capillair en een pipetbol. De capillaire volumes variëren van 1-20 μL. De pipetbol heeft een klein gaatje aan de boven- en onderkant. Het capillair wordt in het onderste gat gestoken en de schaal is zichtbaar. (B) Overzichtsdiagram van hemolymfeverzameling met een micropipette. De insectenbuik wordt naar boven gericht gehouden terwijl een poot wordt losgemaakt, hemolymfe-uitstroom wordt geïnduceerd en de hemolymfe wordt onder een stereomicroscoop in de pipet verzameld. (C) Proces van hemolymfeverzameling met een micropipette. Een van de poten wordt aan de wortel afgetrokken met een pincet met een fijne punt (a) en het lichaam van het insect wordt ingedrukt om hemolymfe naar buiten te laten stromen (b,c). De hemolymfe uit de wond wordt verzameld in het capillair (d). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van de SBPH-hemolymfe. (A) Coomassie Blue-kleuring met drie replicaties van verzamelde larvale hemolymfe. Zoom geeft hemolymfe aan. (B) Totale eiwitconcentraties van de hemolymfe van larvale, vrouwelijke en mannelijke SBPHs. (C) Microscopische beelden van de cellen die aanwezig zijn in de hemolymfe in SBPHs bij respectievelijk 20x en 60x vergroting. De kern was gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. (D) Hemocytendichtheid van larvale, vrouwelijke en mannelijke SBPHs. Het gemiddelde en de SD werden berekend uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Hemolymfe | Eiwitconcentratie (mg/ml) |
| Larve | 3,707±1,382 |
| Vrouwelijk | 3.515±1.400 |
| Mannelijk | 3,621±0,860 |
Tabel 1: Eiwitconcentraties van hemolymfe uit verschillende SBPHs. De gegevens werden verkregen uit drie biologische replicaties.
| Hemolymfe | Celconcentratie (105 / μL) |
| Larve | 1,794±0,614 |
| Vrouwelijk | 1,256±0,603 |
| Mannelijk | 1,553±0,474 |
Tabel 2: De totale concentraties van hemocyten in de hemolymfe van verschillende SBPHs. De gegevens werden verkregen uit drie biologische replicaties.
Aanvullende figuur 1: Bepaling van het aantal cellen. De vier hoekvierkanten (1, 2, 3 en 4) en het centrale vierkant (5) worden geteld op de celtelkamer. Voor randcellen worden alleen de twee grenzen (boven en links) geteld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemolymfe is het medium van de bloedsomloop in geleedpotigen en arbovirussen kunnen alleen andere geleedpotige weefsels binnendringen als ze de vijandige hemolymfe-omgeving kunnen overleven. Het verzamelen van een hoogwaardig monster van hemolymfe is de eerste stap in het bestuderen van de vector-virusinteracties die optreden in de hemolymfe. Er is gemeld dat hemolymfe van insecten kan worden verkregen op verschillende plaatsen op het lichaam van het insect, waaronder een wond op het voorbeen, een kleine incisie in het hoofdgebied of een traanwond in de buik26,27,28,29. Voor bepaalde aankopen kunnen verschillende incassomethoden werken. De methode waarbij een kleine incisie bij het hoofd-nekgewricht wordt gemaakt, is meer geschikt voor hemolymfeverzameling van grote insecten zoals honingbijen26. Het creëren van een wond in het hoofdgebied van de SBPH is een uitdaging omdat het andere organen kan beschadigen en besmetting van andere weefsels kan introduceren. Na het maken van een traanwond in de buik, worden de insecten ondergedompeld in de buffer en vervolgens wordt de buffer gecentrifugeerd om de hemolymfe te extraheren. Dit is een handige methode om lipiden van kleine insecten te verzamelen21. Omdat er echter een grote hoeveelheid vetlichaam in de hemocoel van SBPHs zit, kan een wond op het lichaamsdeel vetlekkage uit de wond veroorzaken en leiden tot de besmetting van de hemolymfe. Deze methode is meer geschikt voor het verzamelen van hemolymfe van volwassen SBPHs, die minder vetlichaam hebben dan larven. Om besmetting van het vetlichaam effectief te voorkomen, wordt aanbevolen om een wond op de plaats van het been te maken in plaats van direct op het lichaam. In eerdere studies van SBPH-hemolymfe werden fijne pincetten gebruikt om het verzamelen van kleine druppels vloeistof uit de wondte vergemakkelijken 13. Hoewel de verzamelde hemolymfe vrij was van onzuiverheden, werd het volume van hemolymfe niet gemeten. In deze studie hebben we een eenvoudige micropipette ontwikkeld die kan worden gebruikt om hemolymfe nauwkeurig en kwantitatief te verzamelen van zeer kleine insectenvectoren.
Voor een succesvolle hemolymfeverzameling moet rekening worden gehouden met verschillende kritische stappen. Ten eerste is het essentieel om de insecten gedurende 15 minuten bij 4 °C te verdoven om hemolymfe te produceren die vrij is van vetlichaam. Ten tweede is het eenvoudiger om pure hemolymfe te verkrijgen door de eerste poot af te trekken. Ten derde moet het verzamelen van de hemolymfe op een continue en snelle manier gebeuren, omdat anders de hemolymfe aan de onderkant kan stollen en het capillair kan blokkeren.
De capillaire afnametechniek is op grote schaal gebruikt voor het afnemen van dierlijk bloed30,31. We hebben de techniek aangepast aan de verschillende kenmerken van hemolymfe van insecten. Omdat SBPH's een kleine lichaamsgrootte hebben, werd gekozen voor een capillair met een minimaal volume van 1 μL. Het gebruik van een capillair met een volume lager dan 1 μL wordt niet aanbevolen. Het is opmerkelijk dat hemolymfe een hoge dichtheid aan eiwitten en een aanzienlijk aantal cellen bevat (figuur 2), die de vloeistofdichtheid verhogen en het moeilijk maken om hemolymfe te absorberen via haarvaten met kleinere volumes.
De methode voor het verzamelen van hemolymfe door capillair is een eenvoudige, kosteneffectieve en levensvatbare techniek die de betrouwbare en nauwkeurige kwantificering van de hemolymfe mogelijk maakt. Deze nieuw ontwikkelde methode kan ook worden toegepast voor het verzamelen van andere sporenvloeistoffen van kleine vectoren, zoals honingdauw. Het is van vitaal belang om te benadrukken dat de insecten in leven blijven na de extractie van hemolymfe met behulp van deze methode. Dit is gunstig voor studies met andere insectenorganen of voor herhaalde hemolymfeverzameling. Dit werk presenteert een waardevolle technologie voor de studie van entomologie en virus-vector interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Key R&D Program of China (nr. 2022YFD1401700) en door de National Science Foundation of China (nr. 32090013 en nr. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
