Verbesserung der Zuverlässigkeit von Prostatatumor-Biobanken durch verbesserte Probenahmetechnik und histologische Charakterisierung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung der Entnahme von Proben aus radikalen Prostatektomieproben. Ziel ist es, Gewebeproben aus den Proben nach anatomisch-pathologischen Kriterien zu kartieren, zu charakterisieren und zu mikro-präparieren, bevor sie in einer Biobank gelagert werden.
Abstract
Die Gewinnung frischer und gut charakterisierter Tumorgewebeproben ist entscheidend für die Durchführung qualitativ hochwertiger “Omics”-Studien. Im Zusammenhang mit Prostatakrebs (PC) kann es jedoch aufgrund der Einzigartigkeit dieses Organs und der hohen Heterogenität, die mit diesem Tumor verbunden ist, eine besondere Herausforderung darstellen. Auf der anderen Seite ist es auch eine faszinierende Herausforderung, Proben vor ihrer Lagerung histopathologisch zu charakterisieren, ohne signifikante Gewebeveränderungen zu verursachen. In diesem Zusammenhang stellen wir eine neue Methode zur Gewinnung, Kartierung, Charakterisierung und Mikrodissektion von reseziertem Prostatagewebe anhand anatomopathologischer Kriterien vor.
Im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Protokollen reduziert diese Methode den Zeitaufwand für die histopathologische Analyse der Prostataprobe, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen, was für die Beurteilung der chirurgischen Ränder entscheidend ist. Darüber hinaus ermöglicht es die Abgrenzung und Mikro-Makro-Dissektion von frischen Prostatagewebeproben, wobei der Schwerpunkt auf histologischen Tumorbereichen liegt, die durch pathologische Kriterien wie den Gleason-Score, Präcursorläsionen (hochgradige intraepitheliale Neoplasie der Prostata – PIN) und entzündliche Läsionen (Prostatitis) definiert sind. Diese Proben werden dann in einer Biobank für spätere Forschungsanalysen gelagert.
Introduction
Prostatakrebs (PC) ist die 2. häufigste Krebserkrankung bei Männern und die 5. häufigste Todesursache weltweit1. Die Behandlung und Prognose des Patienten hängt vom Staging und der Einstufung (Gleason-Score) des Tumors ab, was sich in den höheren 5-Jahres-Überlebensraten von lokalisierten und niedriggradigen Tumoren (Gleason-Grad 6) (99 %) im Vergleich zu hohen Gleason-Tumoren und metastasierten Tumoren (31 %) zeigt2.
Das PC-Lokalrezidiv und das Versagen der Behandlung wurden mit der charakteristischen hohen genetischen Intratumorheterogenität dieses Tumortyps3 in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wird die PC als multifokale Erkrankung mit mehreren Tumorherden mit unterschiedlichen morphologischen, histologischen und molekularen Merkmalen4 angesehen, die unabhängig voneinander oder von einem gemeinsamen Tumorzell-Vorfahren 5 stammenkönnen. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich die Tumorevolution bei Patienten aufgrund spezifischer genetischer Treiber unterscheidet, die die Metastasierung fördern oder die Zelllinie auf die Prostata beschränken können5. Daher ist die molekulare Charakterisierung der verschiedenen Tumorherde nicht nur für eine genauere Diagnose und Prognose von entscheidender Bedeutung, sondern auch für eine maßgeschneiderte und personalisierte Behandlung für den Patienten.
In diesem Zusammenhang bieten die biomedizinische Forschung und integrative Multi-Omics-Ansätze beispiellose Möglichkeiten, Krebserkrankungen in verschiedene Subtypen zu klassifizieren, diagnostische und prognostische Biomarker zu identifizieren und Marker zu entdecken, die mit dem Ansprechen auf die Behandlung zusammenhängen. Darüber hinaus tragen diese Ansätze zu einem besseren Verständnis der Biologie dieser Erkrankung bei 6,7. Biologische Proben, ob Gewebe oder Bioflüssigkeiten, können mit verschiedenen Multi-Omics-Plattformen (Genomik, Transkriptomik, Proteomik, Metabolomik usw.) analysiert werden, um die biologischen Merkmale aufzudecken, die der Pathophysiologie von Krebs zugrunde liegen, und damit die derzeitigen Einschränkungen im Zusammenhang mit genetischer und phänotypischer Heterogenität zu beheben6. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die Qualität der aus Omics-Studien abgeleiteten Daten von der Qualität der von Tumoren entnommenen Proben, ihrer genauen Charakterisierung und der anschließenden Verarbeitung und Lagerung abhängt8.
In diesem Zusammenhang stellt die Gewinnung von frischem PC-Gewebe für die Forschung eine methodische Herausforderung dar, da eine erfolgreiche Tumorprobenahmeschwierig ist 9. Bisherige Methoden beinhalteten Zufallsstichproben nach radikaler Prostatektomie, die zu schlechten Ergebnissen führten10. Neuere Ansätze beinhalten jedoch gezielte Protokolle, die sowohl auf Magnetresonanztomographie (MRT) als auch auf Biopsiedaten basieren, was zu einer verbesserten Wirksamkeit bei der Entnahme von Tumorproben führt11.
Auf der anderen Seite stellt auch die histopathologische Charakterisierung von Proben vor ihrer Lagerung ohne signifikante Gewebeveränderungen eine interessante Herausforderung dar. Daher wird in vielen Fällen die histopathologische Bestimmung von Proben nach ihrer Analyse durchgeführt (z. B. HR 1H NMR-Metabolomanalyse)12. Diese Praxis führt zu unnötigen Kosten, Zeitaufwand und dem Verlust einer erheblichen Anzahl von Proben, die schließlich von der Analyse ausgeschlossen werden (z. B. Proben, die sich nach der histopathologischen Analyse als keine Tumorproben herausstellen). In anderen Fällen erfolgt die histopathologische Charakterisierung der Proben vor ihrer Analyse. In der Tat haben einige frühere Studien versucht, Methoden zur Bereitstellung repräsentativer, qualitativ hochwertiger Forschungsproben aus radikalen Prostatektomieproben für die Genomik und Metabolomik zu standardisieren13,14. Nichtsdestotrotz ist die Probenahmeeffizienz signifikant höher, wenn sie aus bereits histologisch bestätigten Schnitten (88 %) durchgeführt wird, die das Gewebe stören, verglichen mit unbestätigten Schnitten (45 %)1.
Hier wird eine neue Methodik vorgestellt, um diese Einschränkungen zu überwinden, die darauf abzielt, frische und gut charakterisierte PC-Proben vor der Lagerung in der Biobank zu erhalten. Diese Methode wurde in Zusammenarbeit zwischen verschiedenen klinischen Diensten (Urologie, Pathologie und Biobank des Krankenhauses La Fe) entwickelt. Es ist wichtig hervorzuheben, dass Biobanken eine wesentliche Rolle bei der Entnahme, Verarbeitung, Konservierung und Lagerung biologischer Proben spielen und gleichzeitig die hohe Qualität der Proben und Daten sowie die Einhaltung ethischer und rechtlicher Anforderungen gewährleisten 8,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
In jeder Forschungsstudie ist die Gewinnung von Qualitätsproben eine wesentliche Voraussetzung, um systematische Verzerrungen zu reduzieren und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten22. Daher muss die Kontrolle präanalytischer Variablen wie die Temperatur, bei der Proben verarbeitet und gelagert werden, die von der Probenentnahme bis zur Lagerung verstrichene Zeit, die Verwendung sterilisierter Materialien oder die Auswirkungen, die der Zusatz von Konservierungsmitteln oder anderen Zusatzstoffen a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.L. bestätigt einen Postdoktorandenvertrag von “Margarita Salas” (Nummer 21-076) und MAM-T einen Forschungsvertrag von “Maria Zambrano” (Nummer MAZ/2021/03 UP2021-021). Beide Verträge wurden im Rahmen der Europäischen Union (Next Generation EU) finanziert.
Materials
| Cadiere forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471049. 18 uses. |
| Conventional slides | Knittel Glass | 2021 | Ground/ Frosted end |
| Cryostat microtome | Thermo Fisher Scientific | — | Criostato CryoStar NX50 |
| Cryotubes | Greiner Bio-One GmbH | Ref.: 122280. | CRYO S. PP, with screw cap, sterile. |
| Da Vinci surgical system | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | XI model |
| Dissection instruments | Bayer | — | Two tweezers and a surgical blade |
| DPX Eukitt | Medizin- und Labortechnik GmbH | 6.00.01.0001.06.01.01 | |
| Eosin | Agilent | 157252 | |
| Fenestrated bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471205. 14 lives. |
| Force bipolar | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471405. 12 uses. |
| Freezers | Thermo Scientific | MODEL 907. -80 ºC | |
| Hematoxylin | Agilent | 157251 | |
| Inmunohistochemistry Slides | Agilent-Dako | K802021-2 | |
| Large needle driver | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471006. 15 uses. |
| Maryland bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471172. 14 uses. |
| Microscope | Olympus | — | Olympus cx40 |
| Microtome blades | PFM Medical | a35 | |
| Monopolar curved scissors | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 470179. 10 uses. |
| OCT compound | NEG-50 | LOT.117340 | |
| PlusSpeed S Single-use Biopsy Device with beveled tip | Peter Pflugbeil GmbH | PSS-1825-S | |
| ProGasp forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471093. 18 uses. |
| Sample holder Disc | Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts | 30 mm | |
| Tissue ink | Pelikan | 2021 | Ink 4001 brilliant black (301168) |
| Xylol | Quimipur | Ref. 169 |
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