개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상
Summary
이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술 표본에서 샘플 수집을 용이하게 하는 방법을 설명합니다. 목표는 해부병리학적 기준에 따라 표본의 조직 샘플을 Biobank에 저장하기 전에 매핑, 특성화 및 미시적 매크로 절개하는 것입니다.
Abstract
신선하고 특성이 잘 규명된 종양 조직 샘플을 획득하는 것은 고품질 “오믹스” 연구를 수행하는 데 매우 중요합니다. 그러나 전립선암(PC)의 경우 이 장기의 고유한 특성과 이 종양과 관련된 높은 이질성으로 인해 특히 어려울 수 있습니다. 다른 한편으로는, 중요한 조직 변화를 일으키지 않고 보관하기 전에 샘플을 조직병리학적으로 특성화하는 것도 흥미로운 도전입니다. 이러한 맥락에서 우리는 해부병리학적 기준에 따라 절제된 전립선 조직을 획득, 매핑, 특성화 및 미세 절제하는 새로운 방법을 제시합니다.
이전에 발표된 프로토콜과 달리 이 방법은 전립선 표본의 구조를 손상시키지 않으면서 전립선 표본의 조직 병리학적 분석에 필요한 시간을 줄여주며, 이는 수술 마진을 평가하는 데 중요합니다. 또한 Gleason 점수, 전구체 병변(고급 전립선 상피내 종양 – PIN) 및 염증성 병변(전립선염)과 같은 병리학적 기준에 의해 정의된 조직학적 종양 영역에 중점을 두고 새로운 전립선 조직 샘플의 묘사 및 미시적 거시적 해부를 가능하게 합니다. 그런 다음 이 샘플은 후속 연구 분석을 위해 바이오뱅크에 저장됩니다.
Introduction
전립선암(PC)은 전 세계적으로 남성에서 2번째로 흔한 암이며 5번째 주요 사망 원인입니다1. 환자의 치료 및 예후는 종양의 병기 및 등급(Gleason 점수)에 따라 달라지며, 이는 국소 및 저등급 종양(Gleason 등급 6)의 5년 생존율(99%)이 높은 Gleason 등급 및 전이성 종양(31%)에 비해 더 높다는 사실에서 입증되었습니다2.
PC 국소 재발 및 치료 실패는 이 종양 유형3의 특징적인 높은 유전적 종양 내 이질성과 관련이 있습니다. 또한, PC는 다양한 형태학적, 조직학적, 분자적 특성을 보이는 여러 종양 병소를 가진 다초점 질환으로 간주되며4, 이는 독립적으로 발생하거나 공통 종양 세포 조상에서 유래할 수 있다5. 이전 연구에서는 전이를 촉진하거나 세포 계통을 전립선에 국한시킬 수 있는 특정 유전적 요인에 따라 환자마다 종양 진화가 다르다는 것을 보여주었다5. 따라서 다양한 종양 병소의 분자 특성 분석은 보다 정확한 진단과 예후를 제공하는 것뿐만 아니라 환자를 위한 효과적이고 개인화된 치료를 맞춤화하는 데 매우 중요합니다.
이러한 맥락에서 생물의학 연구 및 통합적 다중 오믹스 접근 방식은 암을 다양한 하위 유형으로 분류하고, 진단 및 예후 바이오마커를 식별하고, 치료 반응과 관련된 마커를 발견할 수 있는 전례 없는 기회를 제공하고 있습니다. 또한, 이러한 접근법은 이 질병의 생물학을 더 잘 이해하는 데 기여한다 6,7. 조직이든 생체액이든 생물학적 시료는 다양한 다중 오믹스 플랫폼(유전체학, 전사체학, 단백질체학, 대사체학 등)을 사용하여 분석하여 암 병태생리학의 기저에 있는 생물학적 특징을 밝혀냄으로써 유전 및 표현형 이질성과 관련된 현재의 한계를 해결할 수 있습니다6. 그러나 오믹스 연구에서 도출된 데이터의 품질은 종양에서 수집된 샘플의 품질, 정확한 특성화, 후속 처리 및 보관에 따라 달라진다는 점을 고려하는 것이 중요하다8.
이러한 맥락에서, 연구를 위해 새로운 PC 조직을 얻는 것은 성공적인 종양 샘플링의 어려움으로 인해 방법론적 도전을 제시한다9. 이전의 방법은 근치적 전립선 절제술 후 무작위 표본 추출을 포함했는데, 결과가 좋지 않았다10. 그러나 최근의 접근법은 자기공명영상(MRI)과 생검 데이터를 기반으로 하는 표적 프로토콜을 통합하여 종양 검체 채취의 효능을 개선했다11.
다른 한편으로는, 중요한 조직 변화 없이 보관하기 전에 샘플의 조직병리학적 특성을 분석하는 것도 흥미로운 도전 과제입니다. 결과적으로, 많은 경우에, 샘플의 조직병리학적 측정은 분석 후에 수행된다(예: HR 1H NMR 대사체 분석)12. 이러한 관행은 불필요한 비용, 시간 소비 및 결국 분석에서 제외되는 상당한 수의 샘플(예: 조직 병리학적 분석 후 종양 샘플이 아닌 것으로 판명된 샘플)의 손실을 수반합니다. 다른 경우에는 분석 전에 샘플의 조직 병리학적 특성 분석이 수행됩니다. 실제로, 일부 선행 연구에서는 근치적 전립선 절제술 검체로부터 유전체학 및 대사체학을 위한 대표적인 고품질 연구 샘플을 제공하는 방법을 표준화하려고 시도하였다 13,14. 그럼에도 불구하고, 검체 채취 효율은 조직을 파괴하는 조직학적으로 이미 확인된 절편(88%)에서 수행할 때 확인되지 않은 절편(45%)에서 수행한 경우보다 훨씬 높습니다1.
여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위한 새로운 방법론을 제시하며, 바이오뱅크에 보관하기 전에 신선하고 잘 특성화된 PC 샘플을 얻는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 다양한 임상 서비스(비문과, 병리학 및 La Fe Hospital Biobank) 간의 협력 노력을 통해 개발되었습니다. 바이오뱅크는 생물학적 시료의 수집, 처리, 보존 및 보관에 필수적인 역할을 하는 동시에 시료 및 데이터의 고품질을 보장하고 윤리적 및 법적 요구 사항 8,15,16을 준수한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 연구에서 양질의 샘플을 얻는 것은 체계적 편향을 줄이고 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위한 필수 요건입니다22. 따라서 시료가 처리 및 보관되는 온도, 시료 채취에서 보관까지 경과된 시간, 멸균 물질의 사용 또는 방부제 또는 기타 첨가제의 첨가가 시료에 미칠 수 있는 영향과 같은 사전 분석 변수의 제어는 생물학적 시료와 관련된 모든 프로토콜에서 고려되어야 합니다. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AL은 “Margarita Salas” 박사후 계약 (번호 21-076) 및 MAM-T는 ‘Maria Zambrano’ 연구 계약(번호 MAZ/2021/03 UP2021-021)을 인정합니다. 두 계약 모두 유럽연합(EU)-차세대 유럽연합(EU)의 자금 지원을 받았다.
Materials
| Cadiere forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471049. 18 uses. |
| Conventional slides | Knittel Glass | 2021 | Ground/ Frosted end |
| Cryostat microtome | Thermo Fisher Scientific | — | Criostato CryoStar NX50 |
| Cryotubes | Greiner Bio-One GmbH | Ref.: 122280. | CRYO S. PP, with screw cap, sterile. |
| Da Vinci surgical system | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | XI model |
| Dissection instruments | Bayer | — | Two tweezers and a surgical blade |
| DPX Eukitt | Medizin- und Labortechnik GmbH | 6.00.01.0001.06.01.01 | |
| Eosin | Agilent | 157252 | |
| Fenestrated bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471205. 14 lives. |
| Force bipolar | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471405. 12 uses. |
| Freezers | Thermo Scientific | MODEL 907. -80 ºC | |
| Hematoxylin | Agilent | 157251 | |
| Inmunohistochemistry Slides | Agilent-Dako | K802021-2 | |
| Large needle driver | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471006. 15 uses. |
| Maryland bipolar forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471172. 14 uses. |
| Microscope | Olympus | — | Olympus cx40 |
| Microtome blades | PFM Medical | a35 | |
| Monopolar curved scissors | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 470179. 10 uses. |
| OCT compound | NEG-50 | LOT.117340 | |
| PlusSpeed S Single-use Biopsy Device with beveled tip | Peter Pflugbeil GmbH | PSS-1825-S | |
| ProGasp forceps | Intuitive | PN1052082-US 10/2021 | Part number: 471093. 18 uses. |
| Sample holder Disc | Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts | 30 mm | |
| Tissue ink | Pelikan | 2021 | Ink 4001 brilliant black (301168) |
| Xylol | Quimipur | Ref. 169 |
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