Summary
该方案提供了一种使用悬浮培养条件从诱导多能干细胞(iPSC)生产肾脏类器官的全面有效的方法。本研究的主要重点在于确定初始细胞密度和 WNT 激动剂浓度,从而使对肾脏类器官研究感兴趣的研究人员受益。
Abstract
肾脏类器官可以通过多种方法从诱导多能干细胞 (iPSC) 中产生。这些类器官在疾病建模、药物筛选和潜在的治疗应用方面具有巨大的前景。本文介绍了从 iPSC 创建肾脏类器官的分步过程,从后原始条纹 (PS) 到中间中胚层 (IM)。该方法依赖于 APEL 2 培养基,这是一种确定的、不含动物成分的培养基。它补充高浓度的 WNT 激动剂 (CHIR99021),持续 4 天,然后补充成纤维细胞生长因子 9 (FGF9)/肝素和低浓度的 CHIR99021,持续 3 天。在此过程中,重点是在 iPSC 开始时选择最佳细胞密度和CHIR99021浓度,因为这些因素对于成功生成肾脏类器官至关重要。该协议的一个重要方面是在低贴壁板中悬浮培养,允许 IM 逐渐发育成肾单位结构,包括肾小球、近端肾小管和远端肾小管结构,所有这些都以视觉上可理解的形式呈现。总体而言,该详细方案提供了一种有效且特定的技术,可从不同的iPSC中生产肾脏类器官,从而确保成功和一致的结果。
Introduction
肾脏在维持生理稳态方面起着关键作用,具体取决于其功能单位。排泄废物的肾单位可以调节体液的成分。由遗传突变或其他高危因素引起的慢性肾脏病 (CKD) 最终会发展为终末期肾病 (ESKD)1,2。ESKD显然是由于肾单位的再生能力有限。因此,需要肾脏替代疗法。人类 iPSC 的定向分化能够在体外生成患者特异性 3D 肾脏类器官,可用于研究肾脏发育、模拟患者特定疾病和进行肾毒性药物筛选 3,4。
在胚胎发育过程中,肾脏起源于中间中胚层 (IM),这与原始条纹 (PS) 不同。经典的 WNT 信号通路可能在 FGF (FGF9, FGF20) 和 BMP (通过 JNK 的 Bmp7 信号转导)的协调参与下诱导 IM 的额外分化5,6,7。它们产生肾祖细胞 (NPC) 的两个重要细胞群:输尿管芽 (UB) 和肾间充质 (MM),分别形成集合管和肾单位 8,9。每个肾单位由肾小球和肾小管段组成,例如近端和远端小管,以及 Henle10,11 的环。根据上述理论,目前发表的方案模拟信号级联和生长因子刺激以诱导肾脏类器官5,12。
在过去的几年中,已经开发了许多方案来将人类 iPSC 区分为肾脏类器官 5,6,7,12。Takasato 等 7 优化了 FGF9 替代前 CHIR(WNT 激动剂)治疗的持续时间。根据他们的方案,CHIR 暴露 4 天,然后 FGF9 暴露 3 天,是诱导 iPSC IM 的最有效方法。Transwell过滤器在其程序中用作培养形式;但是,这种方法对于初学者来说很困难。因此,Kumar et al.13 试图改变文化形式,选择暂停文化。他们在第 7 天解离贴壁细胞,以接种在低贴壁板中,以帮助它们组装成含有肾单位样结构的胚状体 (EB)。然而,这些方法的批量效应是显而易见的,尤其是在不同的iPSC中。此外,不同的文献报道了 CHIR 的浓度从 7 μM 到 12 μM 不等 5,13,14。
我们推测细胞密度和CHIR的浓度可能会影响不同iPSC中类器官的产生,这在我们的实验中已经得到了多次验证。本方案略微修改了Kumar等人的研究方法13 ,并为用户提供了分步程序。该方法的时间表和示意图如图 1所示。
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Protocol
用于本研究的 iPSC 是从商业来源获得的。将细胞用 mTeSR 培养基维持在市售的基底膜基质包被板上(参见 材料表)。 表1 包含研究中使用的所有培养基组合物。
1. 接种 iPSC 以分化和诱导后原始条纹 (PS)
- 用 2 mL DPBS 在膜基质包被的 6 孔板上洗涤 iPSC。使用移液器吸出DPBS。
- 加入1mL市售的细胞分离溶液(参见 材料表)以分离iPSCs,并在37°C下孵育5分钟。
- 向 iPSC 中加入 1 mL mTeSR,并确保细胞已从塑料表面抬起。
- 在室温(RT)下以400× g 离心细胞3分钟。重悬细胞沉淀并使用血细胞计数器计数细胞数。
- 将一系列细胞密度接种到涂有膜基质的 24 孔或 6 孔板上,并用补充有 10 μM Rho 激酶抑制剂 (Y-27632) 的 mTeSR 培养(参见 材料表)。将它们在37°C CO2 培养箱中培养过夜。
注:为了诱导 PS,CHIR99021的最佳浓度和合适的细胞密度因不同的 iPSC 细胞系而异。接种密度范围(例如,每平方厘米0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.4 * 10 3个单细胞 )和7μM-12μM的CHIR99021浓度范围。 在同一天开始每种密度和每种CHIR的分化。在 24 孔板中找到最佳浓度的 CHIR99021 和合适的细胞密度,然后在 6 孔板中扩增培养物。在这里,我们提供了一个基于6孔板的方案。 - 第二天,吸出 mTeSR 并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
- 加入 2 mL I 期培养基(含有 8-12 μM CHIR99021 的干细胞分化培养基)(表 1),称为第 0 天。
- 将它们在37°C培养箱中培养4天,每两天更新一次I期培养基。
2. 诱导肾源性中间体中胚层(IM)
- 在第 4 天,取出 I 期培养基并用 2 mL DPBS 洗涤。
- 向细胞中加入2mL II期培养基(含有200ng / mL FGF9,1μg/ mL肝素和1μM CHIR99021的干细胞分化培养基)(表1)。
- 将它们在37°C培养箱中培养,并每2天更新一次培养基,直到第7天。
3. 在悬浮培养中产生肾脏类器官
注意:在第 0 天到第 7 天的观察期间,细胞的状态至关重要。如果细胞表现出成功的扩增并堆积而没有明显的细胞碎片,则表明中间中胚层 (IM) 的成功衍生,表明已准备好进入下一阶段。然而,如果细胞出现初始凋亡的迹象,随后出现坏死或破损,则可能表明CHIR99021浓度或细胞密度不合适。
- 在第 7 天,取出 II 期培养基并用 2 mL DPBS 洗涤细胞。
- 向每个孔中加入1mL细胞分离溶液,并在37°C下孵育5分钟,直到细胞在相衬下折射。
- 将 1 mL II 期培养基移液到细胞中,混合并确保细胞已从表面抬起。
- 将细胞悬液收集在 15 mL 试管中,并在室温下以 400 x g 离心 3 分钟。
- 除去上清液,将细胞沉淀重悬于补充有10μMRho激酶抑制剂(Y-27632)的2mL III期培养基(含有200ng/mL FGF9,1μg/ mL肝素和1μM CHIR99021 0.1%甲基纤维素(MC),0.1%聚乙烯醇(PVA)的干细胞分化培养基)(参见 材料表)。轻轻混合。
- 将细胞悬液和种子以 1:3 的比例混合到 6 孔低粘附板中。将板放在37°C和5%CO 2的培养箱中的轨道振荡器(耐CO2,以60rpm旋转)上。
- 24小时后,除去Rho激酶抑制剂(Y-27632)并加入III期培养基(补充含有200ng / mL FGF9,1μg/ mL肝素,1μM CHIR99021,0.1%MC,0.1%PVA的干细胞分化培养基)。培养 2 天。按照以下步骤更改悬浮培养物中的培养基:
- 用无菌剪刀剪掉 1 mL 移液器的尖端。
- 轻轻摇晃 6 孔板,将类器官排列在板的中间。
- 用准备好的移液器将类器官吸入 15 mL 管中,并让它们静置 5 分钟。
- 吸出上清液并将类器官留在管底部。
- 加入新鲜培养基以重悬类器官,然后重新铺板至 6 孔低粘附板中。
- 继续在培养箱中以 60 rpm 的速度摇动低附着力板。每两天更换一次III期培养基,直到第12天。
- 在第 12 天,将培养基更改为 IV 期培养基(含有 0.1% MC 和 0.1% PVA 的干细胞分化培养基)。
- 每两天更换一次培养基,直到第 25 天。类器官可以从第 12-25 天逐渐发育成成熟的肾单位结构。
4.肾脏类器官的免疫荧光染色
- 将肾脏类器官收集到 15 mL 试管中,并用 2 mL PBS 洗涤。
- 在使其凝固5-10分钟后,将肾脏类器官在新鲜制备的2%PFA中在4°C下固定20分钟。
- 除去PFA,用含有0.3%Triton X-100(0.3%PBST)的1mL PBS洗涤类器官,在振荡器(转速不超过60rpm)上均匀摇动8分钟,静置5分钟,然后除去上清液。重复三次。
注意:类器官可以在 4°C 下储存在 0.3% PBST 中 2-4 周。 - 将固定类器官与10%驴血清在PBST(封闭缓冲液)(参见 材料表)中在4°C下孵育过夜。
- 在封闭缓冲液中以 1:300 的比例稀释一抗(在 材料表中列出)。
- 将类器官与一抗在4°C下搅拌孵育过夜。
注意:确保肾小球和肾小管可以同时在一个类器官上染色。 - 用 1 mL 0.3% PBST 洗涤类器官,在振荡器(转速不超过 60 rpm)上均匀摇动 8 分钟,静置 5 分钟,然后除去上清液。重复三次。
- 将类器官与二抗(列在 材料表中)和DAPI在4°C下搅拌孵育过夜。然后重复步骤 4.7。
注:二抗和DAPI均在封闭液,二抗(1:400)和DAPI(1:1000)中稀释。 - 染色后,用甲醇(25%、50%、75% 和 100% 各 5 分钟)脱水类器官,然后用苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB,1:2 比例)(参见 材料表)渗透 5 分钟。
- 在玻璃底培养皿上清除清除的类器官(参见 材料表),并通过共聚焦显微镜检查它们。
注意:成像时,选择玻璃盘底部的培养皿,渗透时,将BABB直接放入培养皿中,以保持培养皿底部湿润。
5. 体外 葡聚糖摄取试验
- 在第25天,将类器官与100μg/ mL荧光标记的葡聚糖(参见 材料表)在37°C和5%CO2的培养箱中孵育4小时。
- 4小时后,切换到新鲜培养基并使用宽视场荧光显微镜捕获活细胞培养图像。
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Representative Results
IM 的产生是通过使用 GSK3 抑制剂 CHIR99021 激活经典 WNT 信号转导,然后使用 FGF9/肝素来实现的。从第 0 天到第 4 天,iPSC 迅速扩增并呈现菱形或三角形。汇合度达到 90%-100%,并均匀积累至第 7 天。悬浮培养后,聚集体在第 7 天解离后自发形成肾单位结构。通过悬浮培养产生的肾脏类器官显示出管状结构,并且在聚集 18 天后很容易在明场图像中观察到(图 2 和 图 3)。
通常,从 24 孔 iPSC 板的孔开始的一次检测可产生 200-300 个类器官。其中,80%-90%含有肾单位样结构(图2)。对于 hiPSC-B1 iPSC 细胞系,生成肾脏类器官的最佳条件是培养 1.8-2.0 x 104 个细胞,该孔板的孔中含有 8 μM CHIR99021(图 2、图 3 和图 4)。通过每 2-3 天更换一次 IV 期培养基,这些肾脏类器官可以在第 25 天后维持长达 1-2 周。
对整个类器官进行免疫荧光分析,发现存在肾单位片段,包括NPHS1-、突触足蛋白(SYNAPO-)和WT1标记的足细胞、MEIS1/2/3标记的间质细胞、Lotus Tetragonolobus 凝集素(LTL-)标记的近端小管、E-钙粘蛋白(ECAD-)标记的远端小管和GATA3标记的集合管。此外,该方案诱导显示CD31阳性染色的内皮细胞(图5)。
最后, 体外 葡聚糖摄取测定表明肾脏类器官的生理相关功能。将肾脏类器官(第7 + 18天)与100μg/ mL荧光标记的葡聚糖孵育4小时后,观察到右旋糖酐在明场图像中被带入近端小管(图5L 和 图6)。
图 1:实验时间表和协议概述。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:使用不同浓度的CHIR99021从第 0 天到第 7 天生成肾脏类器官。 比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:使用不同浓度的CHIR99021从第 8 天到第 21 天生成肾脏类器官。 比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:第 7 天拍摄的不同细胞密度从 1.5 x 10 4 到 2.2 x 104 个细胞/孔的图像。 比例尺:100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:肾脏类器官的代表性共聚焦免疫荧光图像。 (A,B) D7+11 肾类器官肾单位祖细胞(SALL1,蓝色)、肾小管前聚集体(PAX8,品红色)、足细胞(NPHS1,蓝色)标志物的免疫荧光分析。(C-K)类器官中分段模式的免疫荧光分析显示存在足细胞(NPHS1、NPHS2、SYNAPO和WT1,红色;MAFB,绿色)、近端小管(LTL,白色;LRP2,蓝色;CUBN,红色)、远端小管(ECAD,绿色)、集合管(GATA3,粉红色)、系膜细胞(PDGFR,红色)、间质细胞(MEIS1/2/3,绿色)、整合素β1(TIGB1,绿色)和内皮细胞(CD31,绿色)。比例尺:100 μm (A、C、E-J)、50 μm (B) 和 10 μm (D,K)。(L) 葡聚糖更新试验后肾类器官的免疫荧光分析。比例尺:10μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:第 25 天肾脏类器官的体外功能验证。 (A-D)与 10 kDa 的荧光标记葡聚糖一起孵育的肾脏类器官的实时图像。比例尺:100 μm (A,B);10微米(C,D)。请点击这里查看此图的较大版本.
试剂 | 库存成分 | 工作条件 |
阶段 中等 | ||
阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
CHIR 99021型 | 10微米 | 4-12微米 |
阶段 中等 | ||
阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
FGF9型 | 100纳克/微升 | 200纳克/毫升 |
rHSA(rHSA) | 0.2 克/毫升 | 1微克/毫升 |
肝素 | 2毫克/毫升 | 1微克/毫升 |
CHIR 99021型 | 10微米 | 1微米 |
阶段 中等 | ||
阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
FGF9型 | 100纳克/微升 | 200纳克/毫升 |
rHSA(rHSA) | 0.2 克/毫升 | 1微克/毫升 |
肝素 | 2毫克/毫升 | 1微克/毫升 |
CHIR 99021型 | 10微米 | 1微米 |
聚氯乙烯 | 1% | 0.10% |
司仪 | 1% | 0.10% |
阶段 中等 | ||
阿佩尔 | 不适用 | 不适用 |
聚氯乙烯 | 1% | 0.10% |
司仪 | 1% | 0.10% |
表1:研究中使用的培养基组合物。
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Discussion
已经描述了从 iPSC 生成肾脏类器官的详细方案,包括对基础培养基、初始细胞密度和CHIR99021浓度的微小修改。在各种实验中,发现成功产生肾脏类器官的关键因素是中间中胚层 (IM) 的初始分化和第 7 天的细胞状态。此外,不同的iPSC细胞系表现出细胞增殖和分化潜力的变化,导致不同的最佳细胞密度和CHIR99021浓度5,13,14。因此,确定每个 iPSC 细胞系的理想条件对于从患者特异性 iPSC 中产生大量肾脏类器官至关重要。
为了确定最佳条件,建议使用 24 孔板进行初步实验,然后再将培养物放大到 6 孔板以进行更大规模的生产。此步骤允许研究人员根据细胞形态和数量评估诱导的成功。此外,类器官可以在固定后在其完整结构中保存 2-4 周,增强了该方法的可行性和实用性。
使用该方案生成的肾脏类器官通常测量约为50-300μm,并且在明场显微镜下观察时表现出管状结构。免疫荧光分析证实了肾单位的可靠形成,例如用 NPHS1 和 WT1 标记的足细胞,用 LTL、LRP2 和 CUBN 标记的近端小管,用 ECAD 标记的远端小管,用 GATA3 标记的集合管和用 MEIS1/2/3 标记的间质细胞13。此外,该方案诱导用CD31染色的内皮细胞的存在,表明肾脏类器官内有血管化的可能性。
体外 葡聚糖摄取测定可证明肾脏类器官的生理相关功能,例如初步过滤和重吸收。这使得它们非常适合疾病建模和研究功能障碍的机制。然而,需要注意的是,这些肾脏类器官的成熟度类似于孕早期的人肾,并且在 体外 培养物中它们缺乏脉管系统13。需要进一步的研究来阐明潜在的机制。
总之,所描述的方案提供了一种从iPSCs生成肾脏类器官的有前途的方法,为进一步的研究和研究提供了途径。
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Disclosures
作者报告没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢所有毛和胡实验室成员,无论是过去还是现在,都对这个项目进行了有趣的讨论和巨大贡献。我们感谢国家儿童健康临床研究中心的大力支持。本研究由国家自然科学基金(U20A20351建华毛,82200784立单胡)、浙江省自然科学基金(No.LQ22C070004力丹胡)和江苏省自然科学基金(批准号)BK20210150给王刚)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
Antibodies | |||
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40 A2 | |
Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
Experimental models: Cell Lines | |||
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
Others | |||
Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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